液相色谱-质谱联用法测定大鼠血浆中木通皂苷d的浓度.docxVIP

液相色谱-质谱联用法测定大鼠血浆中木通皂苷d的浓度 延续是中国传统的中药，来自四川延续植物的延续（singetal.c.y.chengetal.）干燥的根。续断皂苷类成分是续断药材主要活性成分,其中木通皂苷D含量最高。续断皂苷具有促进成骨细胞增殖和分化的作用,口服生物利用度较低,药代动力学方面研究的报道较少。本文用液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)建立了大鼠血浆中药物浓度的测定方法,并检测了木通皂苷D大鼠灌胃给药的血药浓度。 1 仪器和试剂盒 1.1 高效液相色谱检测软件 3200QTRAP型液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.2数据处理软件,美国Applied Biosystem公司;Agilent 1100 高效液相色谱系统,包括四元输液泵、自动进样器、切换阀,美国Agilent公司; Eppendorf 离心机(Eppendorf 5415D,德国);YKH-型液体快速混合器,江西医疗器械厂。 1.2 号:国 木通皂苷D标准品(批号:111685-20103,纯度:93.5%),中国药品生物制品检定所;内标替米沙坦对照品(批号074K47102,含量99.0%),Sigma公司;甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。 1.3 中国动物部:syxk京 雄性SD大鼠,体质量180～220g(北京大学动物部),动物许可证号:SYXK(京)2006-0025,饲养条件:室温21～25℃,湿度50%左右,12 h交替照明。 2 方法和结果 2.1 %甲醛-甲醇法 色谱柱:XDB-C18柱(5 μm,150 mm×4.6 mm,美国Agilent公司);流动相:5 mmol/L乙酸铵含0.1%甲酸(A)-甲醇(B),梯度洗脱(表1);流速:1.0 ml/min;柱温:35℃;进样量:20 μl。 2.2 木通皂苷z-3-3-菌株白砂糖 离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:多重反应监测(MRM);检测方式:正离子检测方式;离子喷射电压:5500 V;源内气体1(GS1,N2)压力:50 KPa;源内气体2(GS2,N2)压力:55 KPa;气帘气体压力:20 psi;离子源温度:550 ℃;木通皂苷定量离子对(m/z):946.4→455.3,定性离子对(m/z):946.4→437.3(DP电压:80 V;CE电压:35 eV);内标替米沙坦定量离子对(m/z):515.1→276.1(DP电压:35 V;CE电压:50 eV)。相应的二级全扫描质谱图见图1。 2.3 溶液的制备 2.3.1 储存溶液 精密称取10 mg木通皂苷D标准品,置100 ml容量瓶中,加甲醇溶解,并稀释至刻度,配制成100 μg/ml的储备液。 2.3.2 替米沙坦储备液的配制 精密称取10 mg替米沙坦对照品,置100 ml容量瓶中,加甲醇溶解,并稀释至刻度,配制成100 μg/ml的储备液,取适量替米沙坦储备液用甲醇稀释至100 ng/ml。 2.4 lc-ms/ms分析 精密量取血浆样品50 μl置于1.5 ml EP管中,分别加入50 μl 100 ng/ml的内标溶液和50 μl甲醇溶液,涡旋1 min、离心5 min(16 100×g),取上清液进行LC-MS/MS分析,进样量为20 μl。 2.5 理论与实践的确认 2.5.1 木通皂苷d标准使用液中色谱分析 取空白大鼠血浆样本50 μl,按2.4项下操作,进样20 μl,得色谱图2-A;将一定浓度的木通皂苷D标准溶液和内标溶液各50 μl加入50 μl空白大鼠血浆中,依同法进行涡旋离心处理后进样,得色谱图2-B,取大鼠给药后收集的血浆样品,按2.4项下操作,得色谱图2-C。结果表明,内源性物质不干扰木通皂苷D和替米沙坦的测定。 2.5.2 单次高压离心处理 分别取木通皂苷D储备液适量,用甲醇稀释,配制10、30、50、100、200、500、1000 ng/ml标准系列溶液,分别加入空白大鼠血浆溶液和内标100 ng/ml替米沙坦溶液各50 μl,按2.4项下进行涡旋离心处理,取上清20 μl在LC-MS/MS中进样。以标准曲线样本的实测峰值面积与各自内标峰面积的比值(Y)对标示浓度(X)加权最小二乘法(1/x2)进行线性回归,得到标准曲线方程为Y=0.000116X+0.000762(r=0.9977),线性范围为10～1000 ng/ml,最低定量限为10 ng/ml。 2.5.3 线性关系法对木通皂苷d质量控制单因素试验 按2.5.2项下操作,制备浓度分别为30、100、800 ng/ml的木通皂苷D质量控制(QC)样品,每浓度6个样本,连续测定3 d,根据当日的工作曲线,计算QC样品的测得浓度,计算相对误差(RE)和日内、日间相对标