模拟危重对大鼠门静脉内毒素水平和肝超微结构的影响.docxVIP

模拟危重对大鼠门静脉内毒素水平和肝超微结构的影响 根据中国航空航天“三项计划”的发展战略计划，2012年至2017年完成了第二阶段和第二阶段的任务。这就要求各国在不久的将来能够在地面上连续停留，验证并掌握空间站的基本技术，并为构建空间站奠定技术基础。航天医学保障任务急迫。我国早在20世纪60年代就启动了关于失重问题的医学研究,并取得重大成就。然而,在消化系统失重生理病理学方面则缺乏系统性研究。本研究检测尾悬吊模拟失重大鼠门静脉血流中内毒素含量并在电镜下观察肝脏超微结构改变,在前期研究的基础上进一步探讨微重力环境对肝脏的影响及可能的机制。 1 动物分组、药物试剂和仪器 1.1 材料 1.1.1 实验动物及分组:清洁级成年健康雄性Wistar大鼠84只,体质量280~310 g,由中国农业大学实验动物研究所提供。大鼠适应饲养1周后进行实验,按随机区组设计,2个因素组为模拟失重组和对照组,每个因素组设7个时相组(n=6),包括6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d。 1.1.2 动物模型制作与取材:参照陈杰等的方法采用尾悬吊法建立模拟失重大鼠模型。大鼠单笼饲养,实验组大鼠尾部悬于笼顶,前肢踏于笼底。对照组大鼠置于相同鼠笼中,自由活动。所有大鼠可自由进食、饮水。动物室温度保持在(23±2)℃,每天灯光照明12 h与黑暗交替循环,保持适当湿度及通风条件。实验结束时,腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg,将动物麻醉,无菌操作,经腹正中线剖腹,切取左叶肝组织,浸入3%戊二醛磷酸盐缓冲液固定。门静脉取血,立即全血离心(3 000 r/min)20 min后分装血清,-80 ℃冰箱保存备用。 1.1.3 主要仪器与试剂:透射电子显微镜(JEM-1230, JEOL Ltd., Japan);动态浊度法鲎试剂(湛江安度斯生物公司)。 1.2 方法 1.2.1 门静脉内毒素测定:动态浊度法鲎试验(kinetic turbidimetric limulus test),按试剂盒说明书操作。制定标准曲线。血液样本中含有抑制鲎试验因子,去除抑制因子的预处理采用加热法。应用细菌内毒素测定仪,通过标准曲线定量得出检测结果。 1.2.2 透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察肝组织超微结构:3%戊二醛磷酸盐缓冲液固定的肝左叶组织,1%锇酸固定液复固定2 h (4 ℃),乙醇丙酮逐级脱水,每梯度10 min,丙酮环氧树脂混合液浸泡、包埋,修块,超薄切片,铅铀双重染色,透射电镜观察。 1.3 统计学分析计量资料以ˉx±s表示,结果用SPSS13.0for Windows统计软件进行统计学分析,P0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 模拟失重时间对鼠门静脉内毒素水平的影响 实验组及对照组大鼠门静脉中均可检测到内毒素。与对照组比较,模拟失重6 h大鼠门静脉内毒素水平即明显增高(P0.05),12 h形成高峰,随模拟失重时间延长,门静脉内毒素水平呈下降趋势,5 d组形成低谷,接近对照组水平,7 d组的门静脉内毒素水平又趋升高,但与正常对照组比较差异无统计学意义(见表1)。 2.2 体实和胞质网型 模拟失重组肝组织超微结构发生异常变化,可见肝细胞染色质浓缩边聚,在核膜下成新月形,线粒体肿胀,嵴断裂或消失,部分空泡变性,内质网扩张,呈片层状,胞质内脂滴,出现凋亡小体。实验组大鼠肝脏超微结构变化在尾悬吊第1天、第2天比较明显。对照组肝细胞核圆且居中,核仁明显,胞质内可见丰富的粗面内质网、线粒体核糖原,线粒体的嵴正常、清晰,少见脂滴(见图1)。 3 模拟失重环境下肝超微结构变化及其临床研究 失重是航天员训练和航天飞行中的一个特殊物理现象。半个多世纪的航天实践和研究表明,在失重环境下机体各个系统受到瀑布式的直接和/或间接的失重应激作用,正常生理机能受到影响,甚至导致病理性改变,进而损害航天员健康,影响航天员的特殊训练和航天活动。 国外学者早年对失重肝脏做过一系列研究。Abraham等研究搭乘苏联Cosmos 936生物卫星的大鼠,检测30种碳水化合物和脂质代谢酶以及肝糖原和脂肪酸,发现失重大鼠肝脏的部分代谢酶发生变化,肝糖原较对照组增加2倍,十六烷酸与十六碳烯酸比率显著下降,大鼠返回地面恢复25 d后上述酶的异常转为正常。Merrill等研究搭乘Cosmos 2044生物卫星大鼠的肝脏,发现失重可对肝脏的蛋白质、糖原及多种酶的代谢产生重要影响。Lu等研究模拟失重对药物代谢及肝脏等的影响,发现肝脏CYP2C11、2E1和P-glycoprotein受到明显抑制。Saivin等根据8名志愿者4 d头低位模拟失重下的利多卡因药动学特点,发现模拟失重第1天肝动脉血流速度加快。Clement等应用DNA微阵列技