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红毛七中对主动脉血管有舒张作用的有效成分筛选 传统的自然药物化学筛选方法是先提取分离，然后逐个进行药物特性试验，确定药物的有效性。研究周期通常很长，而且命中率相对较低。而细胞膜色谱法(cell membrane chromatography,CMC)是一种新的生物亲和色谱方法,被分析成分如果与特定的细胞膜受体有特异性结合,则可在CMC模型中反映出来,而且被分析样品可不经提取分离步骤,直接在特定的CMC模型上完成筛选过程。将CMC模型与药效试验相结合的活性成分筛选技术已用于天然植物和中药物质基础的研究之中。本实验报道用血管CMC模型筛选秦巴山区特有植物红毛七(Leontice robustum)中对主动脉血管有舒张作用的有效成分。 1 实验材料 1.1 仪器、试剂和仪器 GILSON 高效液相色谱系统,配有115型紫外检测器,470型色谱泵,7725i型进样器和ANASTAR色谱工作站(法国);Hermel ZK 401 型低温冷冻高速离心机(德国);CS-20型超声波清洗器(日本)。 磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、盐酸、磷酸等均为分析纯(西安化学试剂厂)。三重蒸馏水,本实验室自制。柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶(中国青岛海洋化工集团)。 红毛七为小檗科牡丹草属植物类叶牡丹的根茎及根,采自秦巴山区太白县太白山,非药典收录。经西安交通大学药学院生药教研室吕居娴教授鉴定。 盐酸维拉帕米片(verapamil,VP,天津市中央制药厂),重酒石酸去甲肾上腺素注射液(武汉制药厂)。 1.2 实验动物 健康家兔,雌雄不限(西安交通大学实验动物中心)。 2 方法和结果 2.1 流动相及流速 血管细胞膜固定相(CMSP)的制备参见文献的方法。 色谱柱:50 mm×2 mm,填充血管CMSP;流动相:50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH 7.4);流速:0.5 mL·min-1检测波长:256 nm;柱温:37℃ 。平衡3～4 h后,进样分析。 2.2 红毛七有效零件的选择 2.2.1 萃取溶剂的选择 将红毛七植物晒干碾碎,取5.0 kg,用50%乙醇回流提取3次,每次2 h,合并滤液。回收乙醇。依次用不同极性的溶剂石油醚、乙醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取,得不同极性溶剂萃取液。分别取适量不同萃取液,挥干溶剂,用适量吡啶溶解,得4种不同萃取物的供试品溶液,分别用HMQ-1,HMQ-2,HMQ-3,HMQ-4表示。 2.2.2 血管cmc规律 分别吸取不同萃取物的供试品液(HMQ-1,HMQ-2,HMQ-3,HMQ-4 )5 μL,注入血管CMC系统分析。以VP为对照,结果发现正丁醇萃取物(HMQ-4)中有成分类似于VP在血管CMSP柱上保留(图1),表明正丁醇萃取物(HMQ-4)中可能含有与血管细胞膜及膜受体作用的有效成分。 2.2.3 离体疗效试验 以模型药物维拉帕米为对照,对红毛七的正丁醇萃取部位HMQ-4进行离体药效试验,结果表明HMQ-4对去甲肾上腺素所诱发的血管收缩有显著的抑制作用。 2.2.4 初步结论 红毛七的正丁醇萃取物(HMQ-4)是红毛七中对血管有舒张作用的有效部位。 2.3 红毛七效果的确定 2.3.1 洗脱溶剂的选择 以硅胶为填料,湿法装柱并用洗脱液平衡后,将HMQ-4上柱分离。采用醋酸乙酯-甲醇梯度下行洗脱,根据薄层色谱检验结果收集洗脱液,回收溶剂,得不同的分离样品5份。分别取各样品适量挥干溶剂,用适量吡啶溶解,得各分离组分的供试品溶液,分别用HMQ-41～HMQ-45表示。 2.3.2 红毛七hmq-4对血管cmc系统的活性成分 分别吸取各组分供试品溶液(HMQ-41,HMQ-42,HMQ-43,HMQ-44,HMQ-45)5 μL,注入血管CMC系统分析。以红毛七的HMQ-4为对照,结果发现其中有2个分离组分(编号为HMQ-44和HMQ-42)在血管CMSP柱上有保留(图2),表明HMQ-44和HMQ-42为红毛七HMQ-4中对血管细胞膜及膜受体有作用的活性成分。对其进一步纯化和结构分析的工作仍在进行之中。 2.3.3 对血管的收缩 以模型药物VP为对照,对HMQ-44和HMQ-42进行了离体动脉条药效试验。结果发现:组分HMQ-44对去甲肾上腺素所诱发的血管收缩有类似竞争性拮抗剂的作用,可使去甲肾上腺素引起的动脉条收缩受到抑制,从而具有舒张血管的作用,并存在量效关系(图3)。而组分HMQ-42对去甲肾上腺素所诱发的血管收缩有较弱的促进作用。 3 红毛七药效成分的检测结果 本实验利用血管CMC模型,对红毛七进行了较为系统的分离、筛选和验证,结果被分离组分在模型上的保留特性与其离体药理作用有显著的相关性。同时,进一步确定HMQ-4是红毛七中对血管有舒张作用的有效部位,而HMQ-44则是其主要有效成分。这些结果为研究红毛七的药用