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大肠埃希菌质粒头孢菌素酶基因的初步研究 酶c最初是由抗氨基丙烯酸苯磺酸盐的埃希菌引起的，然后在许多革兰氏阴性杆菌中发现了由染色体诱导的磺c酶c。近十多年来,不断在质粒上发现表达各种AmpC酶的基因。本研究调查我院大肠埃希菌中质粒介导型AmpC酶基因型的分布情况,报道如下。 1 材料和方法 1.1 菌株的质控指标 收集2005～2006年中南大学湘雅三医院住院病人中分离的大肠埃希菌157株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603,产TEM-1、SHV-1、CTX-M-3、DHA-1、ACT-1型β-内酰胺酶的菌株作为对照,由上海瑞金医院临床微生物科提供。 1.2 培养基和试剂 抗生素纸片:头孢他啶(30 μg/片),头孢噻肟(30 μg/片),头孢噻肟/克拉维酸(每片30 μg/10 μg ),头孢他啶/克拉维酸(每片30μg/10 μg),头孢西丁(30 μg/片)及M-H培养基均为英国Oxoid公司产品。阿米卡星(AMK),阿莫西林/克拉维酸(AMC),氨曲南(AZN),头孢唑啉(CFZ),头孢吡肟(FEP),头孢哌酮/舒巴坦(CFS),头孢噻肟(CTX),头孢他啶(CAZ),头孢呋肟(CXM),环丙沙星 (CIP),头孢西丁(FOX),左氧沙星(LVX),哌拉西林(PIP)由中国药品生物制品检定所提供。亚胺培南(IMP)为杭州默沙东公司提供。 1.3 ss基因编码区的处理 根据GenBank收录的质粒型ampC基因和ESBLs基因序列信息,采用Primer Premier 5.0软件包辅助设计,选择各型ampC基因和ESBLs基因编码区(CDS)保守序列设计通用引物。 各型ampC基因和ESBLs基因PCR扩增片段涵盖其大部分CDS及主要氨基酸替代位点, 以便于亚型区分。扩增ampC基因设计5对通用引物,ESBLs基因设计TEM、SHV、CTX-M型3组通用引物,见表1。各引物均由上海生工生物工程公司合成。质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒均为上海生工公司产品。PCR仪为Applied Biosystems公司GeneAmp PCR System 9700。 1.4 最低抑菌浓度测定 根据2005年美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI/NCCLS)出版的药敏试验指南,用琼脂稀释法测定13株CMY-2组和1株DHA-1组PCR扩增阳性菌株对14种抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。 1.5 报道方法及结果 采用K-B法,用FOX纸片检测受试菌株,抑菌圈直径≤17 mm提示对FOX耐药或中介者为疑产AmpC酶株,确证试验参照Coudron报道方法进行。阴沟肠杆菌029M为阳性对照,肺炎克雷伯菌ATCC 700603为阴性对照。 1.6 pcr模型准备 对24株耐头孢西丁菌株按质粒抽提试剂盒说明书提取细菌质粒。以质粒作为PCR模板。 1.7 dntp反应 以上述24株菌株的质粒作模板,进行PCR,反应体系为PCR Premix(TaKaRa,日本)25 μl(含TaKaRa Taq 1.25 U,dNTP各0.4 mmol/L,Mg2+3 mmol/L),primer F 1 μl (20 μmol/L),primer R 1 μl (20 μmol/L), 质粒DNA模板3 μl ,ddH2O 20 μl,反应终体积50 μl。反应条件为:94 ℃预变性3 min,然后进入PCR循环,94 ℃变性35 s,58～60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环,最后72 ℃延伸5 min。 1.8 凝胶纯化产物的测序 用琼脂糖凝胶电泳法,PCR产物在含0.5 μl/ml溴乙锭的15 g/L琼脂糖凝胶中电泳,用凝胶成像系统观察结果,照相后切胶回收纯化。纯化产物直接测序,测序仪器为ABI PRISM 3730,同一样品经正、反测序。所测序列采用DNA star软件进行序列拼接、校正和氨基酸序列的推导,并与GenBank数据库提供的质粒型Amp C酶核苷酸序列进行对比以确定其基因亚型。 1.9 试验结论 13株CMY-2组和1株DHA-1组PCR扩增阳性菌株进行接合实验,步骤参照文献进行。 2 结果 2.1 产酶基因的检测结果 157株中对FOX抑菌圈直径≤17 mm共计24株。其中三维实验阳性者共计16株。 2.2 esbl基因型检测 24株菌株采用通用引物扩增阳性组有:CMY-2组和DHA-1组。其中CMY-2组有13株(图1):EC0501、0504、0512、0517、0519、0520、0543、0545、0550、0554、0562、0578、0583