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瓜类果斑病菌免疫检测试纸条中的缓冲液 西瓜细菌果实的斑点是由碱假单胞菌的pseudiocl生殖生殖生殖生殖生殖生殖生殖生殖生殖生殖生殖。1992年，该菌株改名为嗜酸性麦哲伦西亚公司。主要分布在美国、澳大利亚、马利亚纳群岛、印度尼西亚、土耳其等国。中国台湾和海南省也有分布报道。寄主主要有西瓜、罗马甜瓜、蜜露洋香瓜和网纹洋香瓜等。该病菌人工接种也可以感染其他葫芦科(黄瓜、甜瓜、节瓜、瓠瓜、南瓜、丝瓜、苦瓜、西葫芦)及番茄、胡椒、茄子等。国内外研究表明 ,细菌性果斑病病菌可随种子或病残体在土壤中越冬,以种子带菌为主,且种内、表皮均可带菌。现已证实,哈密瓜种子可带果斑病病菌。病菌在西瓜种子上能存活19年,随种子作远距离传播,0.01%粒种子带菌即可引起西瓜植株发病。Agdia公司开发的瓜类果斑病菌免疫试纸条可用于检测出现症状的植物病组织上是否带有瓜类果斑病菌。本研究以Agdia公司开发的瓜类果斑病菌免疫试纸条检测瓜类种子,通过对瓜子浸提液的培养,可检测出瓜子是否带有该菌。 1 材料和方法 1.1 测试样本 免疫检测试纸条由美国Agdia公司开发。被检西瓜子产自甘肃。 1.2 用制备水浸泡 称取200g待检测瓜子,用1%NaClO 浸泡,表面消毒3min,用无菌水洗涤,用消毒过的破碎机破碎瓜子,用无菌水浸泡,4℃过夜。取浸提液0.7mL加入样品提取网袋中的样品提取缓冲液(随免疫检测试纸条一并提供)中充分混合,从样品提取网袋中取混合液1mL加入1.5mL离心管中,将免疫检测试纸条按说明书要求插入离心管中的混合液,用果斑病菌菌悬液作为阳性对照,30min后,观察免疫试纸条上阳性测试线和阳性质控线出现的情况。 1.3 测定金针菇的发酵 取上述西瓜子浸提液0.3mL加入250mL牛肉汁液体培养基(pH7.0),28℃140r/min 培养72h;用未发生果斑病的瓜子与待检测瓜子作相同处理作为阴性对照;用表面消毒后的未发生果斑病的瓜子破碎后,加入一滴果斑病菌菌悬液(以后处理同待检测瓜子)作为阳性对照。取培养液0.7mL加入样品提取网袋中的样品提取缓冲液中充分混合,从样品提取网袋中取混合液1mL加入1.5mL离心管中,将免疫检测试纸条按说明书要求插入离心管中的混合液,30min后观察免疫试纸条上阳性测试线和阳性质控线出现的情况,根据是否出现阳性测试线判断是否带有果斑病菌。 2 阳性质控线、阴性质控线检测 待测西瓜子的浸提液未经液体培养基培养时,免疫检测试纸条上未出现阳性测试线,仅出现阳性质控线,而阳性对照除出现阳性质控线外,还出现了明显的阳性测试线。 待测西瓜子的浸提液经液体培养基培养后,待测西瓜子和阳性对照同时出现明显的阳性测试线和阳性质控线,阴性对照未出现阳性测试线,而只出现了阳性质控线。 西瓜子表面消毒破碎后的浸提液直接用于检测未出现阳性测试线,而浸提液经液体培养基培养后用于检测出现了明显的阳性测试线,这可能是由于西瓜子浸提液中的果斑病菌浓度较低,不足以使免疫检测试纸条显示阳性测试线,而西瓜子浸提液经过液体培养基培养后,果斑病菌的浓度会随着培养时间的增加而增加,当果斑病菌的浓度达到免疫检测试纸条的检测灵敏度时,则试纸条上会出现阳性测试线。 3 西瓜中的病原菌检测试纸条 在我国,瓜子作为种子或食品原料每年都有大量出口,而一些国家和地区对瓜类果斑病菌有检疫要求,但出口商往往并不事先知道进口方的官方检疫要求,即使事先知道,又往往缺少对瓜类果斑病的认识而未及时在病害发生季节进行田间检疫。从农户采收瓜子到出口企业报检,往往需要较长的时间。在这期间,瓜子中的果斑病菌在凉晒和贮存过程中会迅速减少;相反,瓜子中的一些伴生菌的数量则会迅速上升;因而,在对报检的瓜子进行检疫过程中,很难通过分离的方法获得果斑病菌,尽管出入境检验检疫行业标准SN/T1465-2004《西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法》规定将从“种子中病原菌的分离培养”作为检疫鉴定方法之一,但笔者认为,从报检的瓜子中通过常规的分离培养方法获得病原菌的可能性极小。 免疫检测试纸条用于检测种子是一种简单易行的方法,它对仪器设备和检测人员的技能要求不是十分苛刻,具有基本实验技能和简单的仪器设备即可开展检测工作。由于直接检测瓜子浸提液通常不能出现阳性测试线,而对浸提液进一步培养后能出现阳性测试线,这也间接地证明了瓜子中不仅存在果斑病菌,而且存在活菌,因为只有活菌才能通过培养提高该菌在培养液中的浓度。 当然,用免疫检测试纸条检测出现阳性测试线,只是瓜子中含有果斑病菌的初步证明,尚无含有果斑病菌的直接证据,但在目前直接获得病原菌十分困难的情况下,免疫检测试纸条法可作为一种带菌种子的初筛测定方法。