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谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白基因敲入小鼠异丙酚后诱导ga-ba能神经元活化的研究 异丙醇是一种广泛使用的静脉全身麻醉剂。其主要理气效果之一是意识的消失，但也是对其中心功能位置和机制的研究的阶段。GABA能神经元传递是脑内主要的抑制性神经传递之一, 对意识活动的调节有着关键作用。有大量研究表明异丙酚等多种全麻药物对突触后膜上的GABAA受体敏感, 通过增强其活性达到增强抑制性突触后传递, 这可能是全身麻醉药的主要作用位点之一。然而异丙酚是否也对突触前的GABA能神经元产生直接作用, 目前尚不明确。 材料和方法 1. 只,男性,体重 成年GAD67-GFP基因敲入小鼠 (第四军医大学基础部解剖学教研室提供) 20只, 雌雄不拘, 体重18～20 g。实验组 (n=15) 小鼠腹腔注射异丙酚130 mg/kg, 分别在注射后5 min, 30 min, 1 h进行行为学评分和形态学观察, 对照组 (n=5) 腹腔注射相等体积量的生理盐水。 2. 行为观察 小鼠按上述分组分别腹腔注射异丙酚和生理盐水, 在注射后5 min, 30 min和1 h时按表1的评分细则逐一评分并计算总分。 3. 小鼠免疫总免疫后抗体fosg-b-trs-4-临床 行为学观察后用0.4%戊巴比妥钠深麻小鼠, 打开胸腔, 插管至左心室, 先以20 ml 生理盐水冲洗血液, 再用100 ml 含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1 mol /L 磷酸缓冲液 ( PB, pH 7.4) 灌注固定。灌毕立即取脑, 置于上述新鲜固定液中后固定4～6 h, 再移入含30%蔗糖的PB中至组织块沉底 (4℃) 。将全脑用恒冷箱作连续冠状切片, 片厚30 μm, 隔5张取一张, 分4套收集。从每只实验小鼠全脑切片中挑选一套进行免疫组织化学染色。具体步骤如下: (1) 切片放入小鼠抗Fos IgG (1∶1 000, Abcam) 4℃过夜; (2) 切片放入生物素化的驴抗小鼠IgG (1∶500) 室温孵育6～8 h; (3) 入A, B复合液 (A液, B液以1∶200加入0.05 mol/L PBS, 反应30 min) 反应2 h; (4) 入DAB液 (5 mg DAB, 40 ml 0.05 mol/L Tris-HCl, 反应5 min) 反应5 min; (5) 逐滴加入0.03% H2O2, 直至镜下见Fos表达, 背底不深为宜; (6) 蒸馏水洗片, 终止反应; (7) 裱片后脱水, 脱色, 中性树胶封片, 显微镜 (Olympus) 下观片, 参照Paxinos小鼠脑片图谱光镜下观察并采集图像。上述抗体和复合物的稀释液均用含0.3%的Triton X-100 和0.5%正常羊血清的PBS, 各步骤之间均用PBS 彻底清洗切片。 4. 小鼠与兔血清pbs的制备 取第二套切片进行免疫荧光双标组织化学染色。具体过程简述如下: (1) 切片放入小鼠抗Fos (1∶1 000) 和兔抗GFP (0.5 μg/ml抗体, 4℃过夜; (2) 切片放入生物素化的驴抗小鼠IgG (1∶500) 和Alexas 488标记的驴抗兔IgG (1∶500) , 室温孵育4～6 h; (3) 入avidin标记的Alexas 594 (1∶1 000) 室温孵育1～3 h。上述抗体和复合物的稀释液均用含0.3%的Triton X-100 和0.5%正常羊血清的PBS, 各步骤之间均用PBS 彻底清洗片子。最后裱片, 避光干燥, 封片, 荧光显微镜 (BX51;Olympus) 观察摄片。 5. 阳性细胞计数 在保证各组间各核团计数平面相同的情况下, 使用Image2 Pro Plus 6.0分析软件对10 ×20倍光镜所采集图像进行阳性细胞计数, 每个部位记录4～5个平面后取平均值。计量资料以均数±标准差(ˉx±s)(xˉ±s)表示, 通过SPSS 12.0对组间均数进行单因素方差分析 (one way ANOVA) ,P0.05视为有统计学差异。 结果 1. 不规律物理检验 腹腔注射生理盐水后, 小鼠意识清醒, 活动没有受限。与此相比在腹腔注射异丙酚5 min后, 小鼠即以意识消失, 无有意识的活动, 对外界刺激的反应降低, 通常伴有不规律的抽搐。30 min时, 状态更为平稳, 对外界刺激的反应更低, 肌肉张力低, 很少见到抽搐。1 h时, 仍处于无意识状态, 但肌张力有一定恢复, 常可见不规律抽搐, 对刺激的反应增高。各组行为学评分结果如表2。 2. fos阳性细胞的表达 Fos免疫组织化学染色显微镜照片显示如Fig.1和各脑区Fos免疫组织化学反应阳性的细胞数的差异经t检验如表3所示。我们发现Fos阳性的细胞主要出现在以下5个区域:海马CA1区、丘脑室旁核 (PV) 、