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环境微生物研究中的核酸分子杂交技术 0 核酸分子杂交分析 磷酸分子杂交是20世纪70年代开发的一种分子技术。这是基于dna分子碱性基的互补配合性原理。通过特定cna检测和测量样品的dna或rna，制备混合分子。核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性, 使其广泛应用于环境微生物的检测, 以及定性、定量分析它们的分布、丰度和适应性等研究。 核酸分子杂交技术一般可分为窄缝杂交法、印迹转移杂交法及原位杂交法。窄缝杂交由于特导性及加样准确性较差, 现已较少应用。印迹转移杂交是用放射性同位素探针与滤膜上的DNA或RNA分子杂交, 经显影曝光显示印迹, 可分为Southern印迹杂交和Northern印迹杂交, 分别用于检测DNA和RNA样品。原位杂交法是将经过标记的探针加在组织切片 (包括染色体) 上, 进行显微照相检测目标基因或目标序列在染色体上的位置。 本文主要以荧光原位杂交技术 (Fluorescent in situ hybridization, FISH) 为例, 介绍了该技术的基本原理、操作过程及其在群落多样性、不同种群的空间联系及功能研究等方面的应用, 并对其他几项常用的杂交技术在环境微生物领域的应用进行了介绍和评述。 1 原聚光灯的迁移及其环境微生物的研究 1.1 荧光标记寡核苷酸探针fps 自Giovannoni于1988年首先利用放射性标记的r RNA寡核苷酸探针对细菌进行显微探测以来, 随着具有较高安全性的标记技术的发展, De Long于1989年首次应用荧光标记寡核苷酸探针探测独立的微生物细胞, 此项技术即荧光原位杂交 (FISH) 。该技术是一种根据核酸探针杂交原理, 应用非放射性荧光物质在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。通过在环境样品上直接原位杂交, 既可测定不可培养微生物的形态特征及丰度, 又可分析其空间及数量分布。由于FISH具有在测定过程中不破坏细胞、分辨率高、特异性强、安全快速等优点, 该技术正逐渐在环境微生物研究中被广泛应用。 1.2 同源性微生物细胞的诱导诱导 FISH技术是利用一小段用荧光物质标记过的寡核苷酸序列 (一般为15~30个碱基) 为探针, 将其直接投加到环境样品中, 利用其与样品中同源性微生物细胞内的靶DNA互补配对特性, 经变性退火复性形成探针与靶DNA的杂交体, 在荧光显微镜下直接观察和检测特定微生物的数量与分布。由于16Sr RNA在活性微生物体内功能稳定、分布广泛, 且在系统发育上具有高度的保守性, FISH技术通常选择它作为杂交的靶标分子。再根据该分子的某段特异性序列, 设计相应的寡核苷酸探针, 经荧光检测系统就可实现对待测DNA进行定性、定量或相对定位等分析。 1.3 fish技术在环境微生物研究中的应用 1 生物除磷优势组分与样品的检测比较 除磷细菌和硝化细菌在除磷或脱氮工艺中有重要的研究意义, 但除磷细菌和某些硝化细菌难以用常规方法进行培养, 因此应用传统方法无法对其进行深入研究。有些硝化细菌即使能够培养, 也由于所用的培养基具有选择性, 使得某些易于培养的菌株, 如Nitrosomonas europaea等在培养基中处于竞争优势, 致使得到的优势类群与样品中的实际情况有较大差异。近年来, FISH技术的应用克服了上述困难。 Mamoru对除磷工艺的FISH研究中, 应用ALF1b、HGC和Bet42a探针检测出的细菌量所占比例分别在10%~64%;应用MP2和CF探针探测到的细菌含量在4%以下。在强化除磷 (EBPR) 工艺中, 无论在厌氧或好氧区的活性污泥中都存在着丰富的除磷微生物, 如Bet Proteobacteria亚类的Actinoba cteria、Epbr15、Epbr16和GPBHGC等常见类群。据J R Liu的报道, 应用FISH技术在EBPR工艺中探测到的Rholocyclus也是生物除磷的优势种群。 Wagner和Bruce E R等[4, 5]研究了一套较完善的对硝化细菌检测的FISH技术, 后来随着硝化细菌及氨氧化菌探针的不断推出, FISH技术也被广泛地应用于活性污泥系统、膜生物反应器和硝化流化床反应器等污水处理系统中。 2 微生物菌群的监测 FISH除了在微生物种群监测方面发挥作用外, 还可应用在对特定功能菌的发现和分布研究上, 用某一类功能酶的保守序列作探针, 则对环境中的功能微生物菌群进行监测。如据Bergquist P L等的报道, 用纤维素酶的保守序列作探针, 就可以研究环境中具有纤维素降解能力的微生物的分布。Bot he H等用NSO190或NSO1225作探针, 可检测出环境中的氨氧化细菌的存在。Jiang等应用FISH技术对SBR反应器内好氧颗粒污泥苯酚降解菌群分布进行了研究, 结果阐明好氧颗粒污泥内PG