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环境微生物种群分析中的1ssrrnnadna技术 微生物生态研究中对微生物群的种子和数量进行及时、准确的分析和测定非常重要。传统的微生物分析方法包括显微镜微生物形态观察、选择性培养基计数、纯分离和生化鉴定等。在环境样品的研究中，存在一些缺陷。近年来, 人们运用微生物生物化学分类的一些生物标记, 包括呼吸链泛醌、脂肪酸和核酸, 来进行环境样品中的微生物种群分析。其中, 以16S rRNA/DNA 为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法, 该技术主要利用不同微生物在16S核糖体RNA (rRNA) 及其基因 (rDNA) 序列上的差异来进行微生物种类的鉴定和定量分析。本文主要介绍16S rRNA/DNA分子生物技术的基本方法 (见图1) , 目的是使相关的科研人员能够对16S rRNA/DNA技术有一个比较完整的了解, 并可以开展初步的实验工作。 1 其它病毒pcr 核酸提取是整个16S rRNA/DNA技术的基础, 能否获得具有代表性的核酸样品将决定后续分析的可信性。核酸提取过程包括细胞破碎、杂质去除、溶剂萃取、沉淀分离和核酸纯化。用于破碎微生物细胞的方法有多种, 物理方法包括玻璃珠匀浆, 超声波震荡, 反复速冻-融化, 匀浆器研磨等。化学方法主要是采用表面活性剂和溶菌酶, 或两者并用。这些方法的破碎效率取决于许多因素, 如细胞壁结构、细胞大小、DNA的分子量等。一般来说, 有芽胞、革兰氏阳性、个体小的细菌比无芽孢、革兰氏阴性、个体大的细菌难破碎;比较温和的提取方法, 如反复速冻-融化和化学溶菌, 由于核酸提取不完全, 容易低估样品的微生物多样性;而比较剧烈的提取方法, 如强烈的玻璃珠匀浆和超声波震荡, 则容易将基因组DNA剪切成过小的片段。正因为核酸提取的影响因素这样复杂, 研究人员通常需要根据具体的环境样品对基本提取方法进行修改和优化。 环境样品中提取到的DNA量通常较低, 为了获得能够用于后续分析的大量DNA, 提取纯化后的16S rDNA需要进行多聚酶链式反应 (Polymerase chain reaction, PCR) 扩增。不同PCR 反应中最为特异性的是引物对, 目前已经有适用于不同分类单元的许多引物可用于16S rDNA特异性PCR扩增中。如果需要从rRNA反转录出相应的DNA片段, 则需要进行反转录PCR (RT-PCR) 。 2 凝胶电泳技术 环境样品中的微生物DNA提取物通常是不同微生物的DNA混合物, 经过PCR后, 其产物是序列等长但不同源DNA片段的混合物。混合物中序列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映了原始样品中微生物种群的多样性和不同物种的丰度。如果可以将这些序列等长但不同源DNA片段分离开, 则可对样品中微生物群落的组成进行初步的分析。经过多年的研究, 现在已经有多种DNA指纹技术, 又称为多态性分析, 可以用于上述DNA片段的分离, 它们包括如变性梯度凝胶电泳 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE), 温度梯度凝胶电泳 (Temperature Gradient Gel Electrophoresis, TGGE), 单链构象多态性分析 (Single Strain Conformation Polymorphism, SSCP), 限制性片段长度多态性分析 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP), 末端限制性片段长度多态性分析 (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP)等。 DGGE的原理是:在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度, DNA 双链一旦解链, 其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降;因此, 将PCR扩增得到的等长的DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳, 序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性, 发生空间构型的变化, 导致电泳速度的急剧下降, 以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置, 染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。每个条带代表一个特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带, 一般可视为具有相同的DNA序列。 为取得好的分离效果, 通常在DNA 片段上连接一段长度为30～50碱基富含GC的核苷酸序列, 该序列被称为GC夹板 (GC-clamp) , 这样甚至可以分辨相差一个碱基的序列。DGGE技术快速简便、分离效果好, 已经被广泛用于研究各种环境样品中的微生物, 例如生物膜、活性污泥、土壤、底泥等。 尽管DGGE凝胶上的条带可以在回收后用于测序, 以便进行更详尽的微生物分类分析, 但研究者一般仅利用DGGE等技术