柱层析法分离戊二醛交联胶原纤维中黄烷酮苷和黄烷酮苷元的研究.docxVIP

柱层析法分离戊二醛交联胶原纤维中黄烷酮苷和黄烷酮苷元的研究 结果表明，黄酮类化合物具有很强的生物活性。作为一种游离的糖化合物，它们在植物体内以游离甾醇和糖的形式存在。此外，甾醇和甾醇通常与提取后的天然产品共存。由于黄酮苷和黄酮苷元具有不同的功能特性和作用位点,因此,有必要对黄酮苷及其苷元的混合物进行分离纯化。目前多采用柱层析法对黄酮类化合物进行分离纯化,但传统的柱层析填料如聚酰胺、硅胶和葡聚糖等存在洗脱难和不易再生等问题。近年来,广泛使用大孔吸附树脂进行天然产物的分离纯化。 胶原纤维是一种天然蛋白类高分子,它含有大量的活性基团可以与黄酮类化合物等天然产物形成氢键。本课题组以胶原纤维制备的吸附剂能选择性除去天然产物中的鞣质,并能有效分离黄酮和生物碱混合物。胶原纤维来自家畜动物的皮,资源广泛,且不依赖于人工的合成,与C18硅胶和大孔吸附树脂等常用的分离材料相比,胶原纤维的成本较低。而且胶原纤维还具有良好的生物相容性、可生物降解性及使用安全性。所以,进一步研究胶原纤维对黄酮苷及黄酮苷元等天然产物的分离机理具有重要意义。 黄烷酮是黄酮类化合物的一类重要分支,所以研究以黄烷酮苷和黄烷酮苷元(分子结构如图1所示)为目标分离对象,研究胶原纤维对它们混合物的分离特性。以戊二醛交联胶原纤维制备吸附剂,目的是提高胶原纤维的热稳定性。选择柚皮苷和橙皮苷作为黄烷酮苷的代表性化合物,柚皮素和橙皮素作为黄烷酮苷元的代表性化合物,采用柱层析作为分离方法。 1 实验部分 1.1 trss-4-胶原纤维吸附剂 Agilent1100HPLC高效液相色谱,安捷伦科技有限公司;Aichrombond-AQ C18液相色谱柱,粒径5 μm,直径4.6mm,长度150mm;φ1.6 cm玻璃色谱柱,上海锦华层析设备厂;HL-2型恒流泵、BSZ-100型自动收集器,上海沪西分析仪器厂;2000PC差示扫描量热仪,德国耐驰公司;JSM-5900LV扫描电子显微镜,日本电子株式会社;TriStar3000比表面与孔隙度分析仪,美国麦克仪器公司。 柚皮素、柚皮苷、橙皮素、橙皮苷(陕西慧科植物开发有限公司,纯度均为98%);胶原纤维吸附剂的制备按课题组建立的方法进行;色谱级甲醇;正己烷、无水乙醇均为分析纯。 1.2 胶原纤维的制备 胶原纤维是以牛皮为原料,按常规方法经清洗、碱处理、片皮、脱碱、干燥、研磨等主要过程制备而成。取胶原纤维15 g,用300 mL蒸馏水浸泡12 h。加入10 mL 50%的戊二醛,先于25 ℃下反应1 h,然后于30 ℃下反应4 h。过滤后用蒸馏水洗涤3次,再用无水乙醇洗涤,过滤,最后于45 ℃下干燥12 h得到胶原纤维吸附剂。 1.3 黄烷酮和黄烷酮元化合物的吸附和分离 1.3.1 胶原纤维在碘量瓶中的吸附行为 配制浓度均为30 mg/L的柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素混合溶液,溶剂为正己烷-乙醇溶液(正己烷浓度10%和20%,v/v)和乙醇-水溶液(乙醇浓度70%～100%,v/v)。吸取各混合溶液15 mL,分别加入装有0.15 g胶原纤维吸附剂的碘量瓶中,水浴振荡吸附(25 ℃,转速120 r/min)12 h后过滤,对滤液进行HPLC分析,按式(1)计算混合物中各组分的吸附率。 E=[(A0?A1)/A0]×100%(1)E=[(A0-A1)/A0]×100%(1) 式中,E为吸附率,A0为吸附前HPLC峰面积,A1为吸附后HPLC峰面积。 1.3.2 回收率的测定 取3 g胶原纤维吸附剂装柱,柱高为7.7 cm,柱直径为1.6 cm,床层体积为15.5 mL。用纯乙醇配制浓度为5 mg/mL的柚皮素、柚皮苷、橙皮苷和橙皮素四元混合溶液,吸取1 mL上柱,用20%正己烷-乙醇溶液、90%和70%乙醇-水溶液分步淋洗。每30 min收集10 mL洗脱液,以HPLC分析洗脱液中各组分的浓度,并按式(2)计算回收率。 R=M1/M0×100%(2)R=Μ1/Μ0×100%(2) 式中,R为回收率,M0为分离前目标组分的质量,M1为分离后目标组分的质量。 1.3.3 各因素的影响 对柚皮苷和柚皮素混合物,考察淋洗剂极性对其分离特性的影响。上样1 mL,分别用极性相对较强的100%乙醇和极性相对较弱的20%正己烷-乙醇进行第1步淋洗,再用80%乙醇-水溶液进行第2步淋洗。 1.3.4 胶原纤维柱的设置 对柚皮苷和柚皮素混合物,考察胶原纤维柱的柱长对其分离特性的影响。分别用3 g和8 g胶原纤维吸附剂装柱,柱长分别为7.7 cm和19.8 cm。上样1 mL,采用100%乙醇和80%乙醇-水溶液进行分步淋洗。 1.3.5 回收率和纯度 以柚皮素和柚皮苷为目标分离物,上样1 mL,用20%正己烷-乙醇和80%乙醇-水进行分步淋洗,如此重复5次,并按1.3