生防细菌侧孢短芽孢杆菌的分离鉴定及其对病原真菌的拮抗作用.docxVIP

生防细菌侧孢短芽孢杆菌的分离鉴定及其对病原真菌的拮抗作用 植物原生植物是植物的一个重要源植物。这种大规模的袭击给农业和食品生产带来了严重危害。随着人们对环境问题的日益重视, 探索可持续发展的、有效的生物防治措施已成为植物病害综合治理中的重要课题。土壤是微生物的天然培养基, 生存着许多具有复杂相互作用的微生物, 它们共同构成了无比丰富的菌种资源库。微生物的拮抗通常指微生物通过产生特定代谢产物, 尤其是抗生素类物质而抑制其他微生物的生长甚至杀死它们的一种相互关系。充分考虑到植物与微生物之间的相互作用关系, 通过对根际土壤中的微生物进行筛选, 有望获得具有良好定殖能力的微生物菌株, 接种后能在植物根系周围长期发挥特定的生防作用。 作物长期连作后, 土壤微生物种群会发生明显变化。关于连作障碍的调查研究表明, 土传病害是引起连作障碍的主要因子之一。经验证, 微生物自身所产生的酶具有一定的生防效果, 尤其是胞外蛋白酶对土壤病害和线虫都具有显著的抑制和杀灭效果。 本研究从山东泰安各种类型土壤中, 分离筛选出一株生防效果较好的细菌, 对其进行形态学、生理生化特征和分子鉴定, 并进一步探究其生物学特性和抗菌谱, 为开发利用微生物资源, 筛选与环境相容性好的微生物生防菌剂奠定基础。 1 材料和方法 1.1 菌株来源药物、微生物 生防细菌AMCC 100017由山东农业大学资源与环境微生物研究室分离、鉴定并保藏。 植物病原真菌:串珠镰刀菌 (Fusarium moniliforme) 、尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum) 、腐皮镰刀菌 (Fusarium solani) 、层出镰刀菌 (Fusarium proliferatum) 、水稻纹枯病菌 (Rhizoctonia soloni) 、芦笋茎枯病菌 (Phomopsis asparagi) 、小麦根腐病菌 (Helminthosporium sativum) 、小麦曲根霉 (Rhizopustritici sp.) 、小麦纹枯病菌 (Rhizoctonia cerealis) 、黄瓜炭疽病菌 (Colletotrichum lagenarium) 、苹果轮纹病菌 (Physalospora piricola) 和桃根霉病菌 (Rhizopus sp.) 均由山东农业大学资源与环境微生物研究室保藏。 1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 (NA) 、LB培养基和PDA培养基配方见《微生物学实验》。 1.3 土样的制备 从山东泰安林地、果园和农田采集地表下5-10 cm处土样, 采用平板稀释分离法涂布, 28°C培养1-2 d。根据单菌落大小、表面结构、质地、光泽和颜色等特征, 挑取菌落形态差异明显的单菌落, 纯化后斜面保存。 1.4 平板对称法 以串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌作为靶标筛选拮抗菌, 采用平板对峙法, 每处理3次重复。30°C培养3-5 d后, 根据抑菌带的大小, 选择拮抗效果好的菌株进入下一轮复筛, 进一步确定抑菌效果最佳的分离菌株。 1.5 抗感染药物的分类和评价 1.5.1 菌落形态特征 参照《常见细菌系统鉴定手册》中的形态学指标, 记录菌落形态、光学显微形态并拍摄透射电镜照片 (37°C平板培养24 h, 透射式电子显微镜型号:JEM-1200EX) , 以确定其形态特征。 1.5.2 菌株生理生化指标测定 参照《常见细菌系统鉴定手册》中的生理生化鉴定指标, 对待测菌株进行V-P试验、M.R试验、耐盐性试验、接触酶试验、糖醇发酵试验、淀粉水解和明胶液化等生理生化指标测定。 1.5.3 细菌基因组dna的提取 将待测菌株接种于LB液体培养基中, 37°C、180 r/min摇床过夜培养, 12 000 r/min离心收集菌体, 用试剂盒 (北京天根生物科技有限公司) 提取细菌基因组DNA。使用细菌16S r RNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′) 和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTC ACCCC-3′) 对提取的基因组DNA进行PCR扩增 1.6 生长曲线测定 37°C摇床培养不同时间后, 通过比色法, 在600 nm波长下测定OD值, 以时间为横坐标, OD值为纵坐标作图, 绘出待测菌株的生长曲线。 1.7 接种病原菌和分离病原菌的培养 采用平板对峙法, 分别用菌块和菌悬液, 在新鲜的PDA固体培养基上距中心3 cm的两个对称点处接种病原菌和分离到的拮抗菌, 用只接病原菌的平板做对照。30°C培养, 待对照组长满整个培养基平板后, 测量实验组病原菌生长半径r, 对照组半径为培养皿内半径r0, 利用公式:抑菌率= (r0-r) /r0, 通过比较抑菌率的大小来评价抗病菌的拮