白花蛇舌草提取物对bel722细胞抗肿瘤作用机制研究.docxVIP

白花蛇舌草提取物对bel722细胞抗肿瘤作用机制研究 1 材料和方法 1.1 材料表面 1 双蒸法制备法 中药白花蛇舌草（olen）从中药房购买生药，将中药白花蛇舌草高速粉碎成粉末，浸泡在70蒸馏水中，滚18h，过滤上清液，在0.0850.095pma、60c温度下蒸发，得到浸泡石膏，然后通过100米的真空，在40c下冷却、干燥并成褐色粉末。 将粉末溶于新鲜的双蒸水中, 之后用0.22 μm孔径滤膜过滤除菌, -20 ℃避光保存, 使用时用无血清培养基稀释到所需剂量, 4 ℃保存. 2 2细胞系统 细胞株Bel-7402来自中国医学科学院药物研究所. 3 药物、药物和药物 RPMI1640、胰蛋白酶、conA (刀豆蛋白) 为Gibco, USA产品; 噻唑蓝 (MTT) 、二甲基亚砜 (DMSO) 、Hepes均为Sigma公司, USA产品;小牛血清购自北京鼎国生物公司;长春新碱 (VCR) 购自扬州奥赛药业有限公司;维拉帕米 (VRP) 购自上海禾丰制药有限公司;青霉素 (100万U) 、链霉素 (160万U) 为东北制药厂产品. 4 老鼠 昆明鼠. 1.2 方法 1.2.1 生活质量改善的对照组 参照Alley的MTT法, 以5 000个/孔细胞的量接种于96孔细胞培养板中, 每孔体积200 μL, 37 ℃ 5%?CO2培养24 h.待细胞贴壁后, 将细胞分为实验组和对照组.实验组Ⅰ只加不同浓度的中药制剂;实验组Ⅱ同时加入不同浓度中药制剂和终浓度为0.02 mg/L的VCR.对照组Ⅰ为不加细胞的空白对照组;对照组Ⅱ为不加任何药物的阴性对照;对照组Ⅲ为抗癌药对照, 只加终浓度为0.02 mg/L的VCR;对照组Ⅳ为逆转剂阳性对照, 同时加入终浓度为5 mg/L的VRP和0.02 mg/L的VCR.对照组及实验组每一剂量重复孔数为3孔.加样后, 在37 ℃ 5%?CO2及饱和湿度条件下, 培养72 h, 每孔再加入MTT溶液 (5 g/L) 20 μL, 4 h后终止培养, 吸弃MTT, 每孔加入DMSO 150 μL, 在微量震荡器上震荡10 min, 使结晶物充分溶解, 490 nm比色, 酶标仪自动打印记录结果. 1.2.2 细胞培养板tt-pcr 脾淋巴细胞制备:无菌条件下取脾, 并以180目细胞筛用注射器芯研磨, 用RPMI1640冲洗, 离心, 计数, 制成2×106/mL悬液 (含10%FBS) . 加板 (96孔板) :细胞悬液200 μL/孔;24 h后加ConA 10 g/L, 0.1 μL/孔+药OLEN;37 ℃ 5%?CO2培养72 h后, 每孔加MTT溶液 (5 g/L) 20 μL;37 ℃ 5%?CO2培养4 h后, 将细胞培养板离心1 500 r/min, 10 min;之后弃上清, 再加DMSO 150 μL/孔, 在微量震荡器上振板10 min, 490 nm比色, 酶标仪自动打印记录结果. 1.2.3 细胞形成率检测 收集处于对数生长期的细胞, 接种细胞于25 mL培养瓶中, 每瓶1 000个细胞, 37 ℃ 5%?CO2培养.待细胞贴壁后, 再加入药物.37 ℃ 5%?CO2继续培养4d后, 于倒置显微镜下观察集落形成情况.计数集落数, 多于50个细胞者记为集落, 按下式计算集落形成率, 集落形成率 (%) =克隆数/接种细胞数×100%. 1.2.4 半薄切片观察 取对数生长的Bel-7402细胞, 用0.25%胰酶消化后离心900 r/min, 7 min, 用含FBS的RPMI1640培养液配制成单细胞悬液, 接种于50 mL的培养瓶内, 使其终浓度为5×104/mL.24 h后加药, 并设空白对照组, 继续培养56 h后, 将细胞离心1 500 r/min, 10 min, 成团后, 取沉淀细胞团, 经2.5%戊二醛前固定, 1%锇酸后固定, 乙醇系列脱水, Epon812环氧树脂包埋, LKB-Ⅲ型超薄切片机半薄切片定位后做超薄切片, 醋酸双铀及柠檬酸铅双重染色, JEM-1200EX型透射电子显微镜观察、对比观察其超微结构的变化, 并摄片. 1.3 统计处理 所有数据均采用t检验. 2 结果 2.1 白花蛇舌草提取物对大、小鼠bel-712细胞内表达的抑制率 白花蛇舌草提取物作用Bel-7402细胞72 h后, 细胞生长受到抑制, 而且抑制作用呈浓度依赖关系.见图1. 从图1可以看出, 白花蛇舌草提取物对多药耐药细胞Bel-7402作用72 h后的抑制曲线, 这条曲线呈对数曲线, 随着白花蛇舌草提取物浓度的增大, 对Bel-7402细胞的抑制率逐渐增加.从曲线中可得出IC50为1.6 g/L. 2.2 bel-712细胞后4d集落形成率 白花蛇舌草提取物作用Bel-