细菌和细菌rada基因的突变体对rda的敏感性.docxVIP

细菌和细菌rada基因的突变体对rda的敏感性 rad蛋白是rad51的一个超家型。这类超家型通常存在于细菌、老细菌和真核细胞中。与细菌中的rad蛋白相比，这一古老的细胞蛋白和真核细胞的rad51蛋白在多个区域内的搜索和交换反应中起着重要作用。与细菌中的rad蛋白相比，古细胞rad蛋白的氨基酸序列和真核细胞rad51蛋白的氨基酸序列更为相似。古细胞rad蛋白和细菌中的reca蛋白具有相似的功能，在群落重组和对dna损伤的恢复过程中也起着重要作用。真核细胞的rad51细胞有一个非常保守的心脏区域，而细菌的reca蛋白则没有。然而，对于rad51、细菌rad5和c-末年的细菌，rad51的蛋白可以用作一个复合词的双链dna。真核细胞中的rad51蛋白可以与其他蛋白相互作用，如rad2、rad54、rad55、57、p53、rad1和rad2。人类rad51基因的第一阶段组成了一个dna组合区域。该结构区可以具有细菌rad-末端结构区的功能，但它们之间没有结构同源性。 大肠杆菌RadA首次被发现, 是由于这个基因的突变增加了大肠杆菌对γ射线辐照的敏感性.大肠杆菌radA基因的突变轻微降低了大肠杆菌对紫外线和γ射线辐照的抗性.进一步的研究发现, 它参与了复制叉迁移过程.以上结果说明, 大肠杆菌RadA蛋白参与了同源重组过程. 耐辐射奇球菌具有超强的辐射抗性, 对其他DNA损伤因子也具有很强的抗性, 如紫外线、过氧化氢和干燥.这种超强的辐射抗性是由于它具有不同寻常的染色体结构以及高效的DNA损伤修复系统[23～25].在所有的DNA损伤类型中, 双链DNA断裂对于细胞的生存是致命的.在大肠杆菌中, 双链DNA断裂的修复过程是RecA依赖的, 并且需要其他途径的参与, 如RecBCD和RecFOR途径.耐辐射奇球菌不具有完整的RecBCD途径, 只有一个RecD类似的亚基, 然而它具有完整的RecFOR途径.研究表明, 耐辐射奇球菌RecA蛋白具有大肠杆菌RecA的所有3种活性, 但它利用与大肠杆菌RecA蛋白相反的机制进行DNA链交换反应.利用PSI-BLAST方法, 我们发现, 与古细菌和真核细胞中的RadA氨基酸序列相比, 耐辐射奇球菌RadA蛋白的氨基酸序列与细菌中的RadA氨基酸序列更相似.到目前为止我们仍然不知道耐辐射奇球菌RadA蛋白是否也参与了同源重组过程. 本研究利用反向插入突变的方法构建了耐辐射奇球菌radA突变体, 并研究了耐辐射奇球菌RadA蛋白可能的生物学功能.结果表明, 耐辐射奇球菌RadA蛋白参与了DNA损伤修复过程而且它不同的结构域行使不同的功能. 1 rada突变体的构建 (ⅰ) 菌株、质粒及生长条件.本研究涉及的所有菌株和质粒见表1.耐辐射奇球菌培养于30℃TGY液体培养基或含1.5%琼脂的固体培养基.大肠杆菌的DH5α菌株购自Invitrogen (La Jolla, CA) 公司, 培养于37℃LB液体或固体 (含1.5%琼脂) 培养基.抗生素在需要时以合适的浓度添加到培养基中:氨苄青霉素, 50μg/mL;卡那霉素, 20μg/mL;氯霉素, 3μg/m L. (ⅱ) 耐辐射奇球菌radA突变体的构建.耐辐射奇球菌radA基因的突变根据文献的方法进行.利用引物 (5′-GAGTTGTTGGAGGGCGAT-3′和5′-AA-CGGCTTTCACGGCTTCTT-3′) PCR扩增含有radA基因的片段.将PCR产物连接到p MD18-T载体 (TaKaRa, 日本) 上, 获得的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中扩增.提取的质粒鉴定后用Bss HⅡ酶消化并连接到含抗卡那霉素抗性基因和groEL启动子的Bss HⅡ片段上.将获取的质粒线性化并转化到处于指数生长期的耐辐射奇球菌R1.在含20μg/mL卡那霉素的TGY固体培养基上初步筛选到具有卡那抗性的重组体, 并通过PCR验证基因是否被破坏.得到的突变体命名为MR. (ⅲ) 补偿质粒的构建.首先用引物5′-GG-AATTCCATATGGAGCGGGTGGCGG-3′和5′-CGCG-GATCCTCAGCGCCAAACGGCTTTC-3′从耐辐射奇球菌基因组中扩增radA基因序列.PCR产物测序结果表明无任何突变引入.用NdeⅠ和Bam HⅠ内切酶将PCR产物酶切并克隆到预先用相同酶消化过的pRADK载体上, 获得质粒pRADKradA-D.补偿质粒pRADKradA-E (表达大肠杆菌RadA蛋白) 通过与pRADKradA-D相似的方法构建, 所用引物为:5′-GGAATTCCATATGGTGGCAAAAGCTCCAAAAC-3′和5′-CGCGGATCCTTATAAGTCGTCGAACACGCTA-AG-3′.为了深入研究耐辐射奇球菌RadA蛋白的功