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无机活性元素对上皮细胞增殖分化的诱导作用 伤口愈合的基本条件是表皮中活性物质的增生、分离和转移。寻找一种即能诱导上皮细胞增生、分化,又具备生物稳定性和安全性的创面治疗制剂是创伤领域的研究方向。本研究中,笔者应用生物诱导制剂诱导正常人上皮细胞的增殖与分化,并试用于动物创面模型及临床Ⅱ度烧伤和糖尿病足溃疡创面,以期寻找一种新的创面治疗途径。 数据和方法 一、 山西合成单—无机活性材料性状与来源 无机活性元素由江苏阳生生物工程有限公司提供,商品名为德莫林,批其主要成分为特定含量比例的钙(质量分数20%)与磷(质量分数4%),呈白色粉末状,颗粒直径20～350 μm,颗粒内含nm级微孔,比表面积165 m2/g。 二、 细胞实验 1. 上皮细胞培养 取7例男性患者(18～25岁)腹部手术剩余的正常皮肤组织1 cm×2 cm,按常规方法经组合胶原酶重复筛选培养获得上皮细胞。 2. 分组及测定指标 取第3代上皮细胞(接种密度4×106/cm2)用于实验。将细胞分为实验组和对照组。来源于同一患者的上皮细胞作为1个样本,每组每项数据重复测定7个样本。实验组细胞用含20 g/L德莫林的DMEM培养液(美国Life公司)培养,对照组用不添加德莫林的DMEM培养液培养。 3. 细胞培养和抗增育 (1)细胞增殖倍数:用结晶紫染色法分别测定上皮细胞接种后16 h及12、20 d时的贴壁细胞数。(后两个时相点的贴壁细胞数-接种后16 h的贴壁细胞数)÷接种后16 h的贴壁细胞数=后两个时相点的细胞增殖倍数。(2)Ⅳ型胶原和表皮生长因子(EGF)合成量:用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测。在细胞接种后12、20 d收集培养上清液,分别以单克隆鼠抗人Ⅳ型胶原抗体(美国DACO公司)和多克隆兔抗人EGF抗体(美国Abcam公司)标记,随后加入相关羊抗鼠或抗兔IgG碱性磷酸酶复合物二抗(美国DACO公司)。以对硝基苯磷酸(美国DACO公司)为底物,用酶标仪(40014型,美国Spectronic公司)在波长405 nm下检测Ⅳ型胶原和EGF的含量。 三、 动物实验 1. 同体对照实验 雄性SD大鼠(中国科学院上海实验动物繁殖中心)60只,体重220～240 g。以常规水浴法在大鼠背部制成对称性的10%TBSA浅Ⅱ度烫伤创面(30只大鼠60个创面)或同面积深Ⅱ度烫伤创面(30只60个)。采用自身同体对照法进行实验,将大鼠背部两侧的创面各分为治疗组和对照组,治疗组创面均匀撒布德莫林1 g/100 cm2并覆以消毒油纱布;对侧的对照组创面涂抹10 g/L的磺胺嘧啶银(SD-Ag)冷霜并用油纱布覆盖。 2. 管理模式观察 于大鼠治疗3、5、7、10、14、18 d时切取其创面全层皮肤作病理学观察,计算创面愈合率。浅Ⅱ度创面观察前5个时相点,深Ⅱ度创面观察后5个时相点,每个时相点6只大鼠。 四、 临床应用 1. 浅、深度、执度、手术愈合试验 (1)临床资料:经江苏省药品监督管理局批准,在上海第二医科大学瑞金医院烧伤科、解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所、北京军区总医院烧伤科进行德莫林的临床应用研究。采用随机、双盲、同体对照法,共选择90例烧伤患者,其中浅Ⅱ、深Ⅱ度患者各30例60个创面,面积均为5%～10%TBSA;供皮区创面30例60个,创面深度0.15～0.25 mm。(2)分组:治疗组浅Ⅱ、深Ⅱ度及供皮区创面(各30个)均匀撒布德莫林1 g/100 cm2后覆盖凡士林纱布,换药1次/3 d;对照组各种创面(各30个)使用5 g/L碘伏或10 g/L的SD-Ag冷霜凡士林纱布。(3)观察指标:计算浅Ⅱ、深Ⅱ度创面治疗第5、10天时的创面愈合率,记录浅Ⅱ、深Ⅱ度创面以及供皮区创面的愈合时间。观察患者治疗前后血、尿常规及肝、肾功能指标有无改变,创面有无细菌感染。 2. 德莫林临床应用研究 (1)临床资料:经江苏省药品监督管理局批准,选择上海第二医科大学瑞金医院内分泌代谢病科的糖尿病足患者60例进行德莫林的临床应用研究。病例纳入标准:应用现有的糖尿病足治疗方法后均未取得满意疗效者。(2)治疗:患者足部溃疡创面清创后,均匀撒布德莫林1 g/100 cm2并覆盖凡士林纱布,换药1次/d,治疗2周。(3)观察指标:测量患者治疗前后足部溃疡的面积,并观察其血常规及肝、肾功能指标有无改变,创面有无细菌感染。 五、 动物实验结果与临床研究结果 数据用xˉ±sxˉ±s表示。细胞学实验数据以ANOVA与Tukey HSD方法分析。动物实验与临床研究结果先进行意向性分析和符合方案数据分析,后作双侧统计学检验。所有的统计分析均采用NIH和SPSS 11.0统计软件完成。 结果 一、 细胞实验 培养12、20 d时,实验组细胞的增殖倍数及培养上清液中Ⅳ型胶原、EGF