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在体单向肠灌流法研究瑞香素肠吸收机制 对药物设计中残留的残余作用具有重要意义。目前预测药物小肠吸收状况的方法主要分为离体法和在体法。在体法中的大鼠单向肠灌流法能很好地模拟人体的体内环境,且结果与人体试验结果相关性良好,得以广泛应用。 祖师麻为瑞香科植物黄瑞香(Daphne giraldi Nitsche)、陕甘瑞香(Daphne tangutica Maxim或Daphne retusa Hemsl)的干燥茎皮和根皮,具有祛风湿,活血止痛的功效。临床上主要用于风湿痹痛、关节炎、类风湿性关节痛。前期实验发现祖师麻中的瑞香素(也称祖师麻甲素)含量较高,且与抗炎镇痛和免疫作用密切相关,为祖师麻治疗类风湿性关节炎的主要活性成分。 上世纪80年代初,国内有学者对瑞香素的代谢及药代动力学进行了研究。结果表明,瑞香素半衰期较短,主要经肾排泄,且排泄较快,在体内能快速分布并消除。但由于当时条件有限,研究尚不够深入,限制了祖师麻药材及制剂的进一步开发和利用。本文采用大鼠在体单向肠灌流模型考察瑞香素的吸收特性,以揭示瑞香素的肠道吸收机制,从而为瑞香素及祖师麻的剂型选择和新剂型开发提供科学依据。 ph、小鼠肠道吸收瑞香素的检测 仪器 TU-1800S紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Agilent1100型高效液相色谱仪,HP1100型二极管阵列检测器,Agilent ChemStation色谱工作站(Agilent科技有限公司);BT00-300M恒流蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)。 药品及试剂 瑞香素原料药(金坛市思达化工有限公司,纯度98%);瑞香素对照品(中国药品生物制品检定所,批号:0900-200102);酚红(上海试剂三厂);水合氯醛(中国医药集团上海化学试剂公司);甲醇、冰醋酸(色谱纯),其他试剂均为分析纯。 动物 SD大鼠,雌雄各半,体重300~350 g(南京中医药大学实验动物中心)。 溶液的配制 瑞香素对照品储备液的配制:取瑞香素对照品适量,精密称定,置于10 mL量瓶中,加甲醇超声溶解,定容,摇匀得质量浓度为0.814mg·mL-1的溶液,4℃放置,备用。 瑞香素原料药储备液的配制:取瑞香素原料药20 mg,精密称定,用DMSO 0.5 mL溶解,得到40mg·mL-1的原料药储备液,摇匀,4℃放置,备用。 含酚红的Krebs-Ringer试液(K-R试液,pH 6.0):称取CaCl20.37 g,葡萄糖1.4 g,分别加少量蒸馏水使溶解,再称取酚红20 mg、NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、Mg Cl20.02 g,加蒸馏水溶解后与溶解的CaCl2及葡萄糖混匀,蒸馏水定容至1 L,再用1 mol·L-1HCl调pH值为6.0,备用。 瑞香素肠灌流液的配制:精密吸取瑞香素原料药DMSO储备液适量,用含酚红的K-R试液稀释定容至200 mL,配制质量浓度为10、20和40μg·mL-1的供试液。 空白肠灌流液:K-R灌流液适量,按下述“大鼠在体单向肠灌流实验”方法灌流,收集流出液,即得。 大鼠在体单向肠灌流实验取禁食(不禁水)16 h的大鼠,称重,10%水合氯醛麻醉(3.4 mL·kg-1),沿腹中线打开腹腔,小心分离出待考察肠段,即十二指肠、空肠、回肠和结肠,取约10 cm于两端切口插管,结扎,用预热至37℃的生理盐水将肠内容物冲洗干净,再用空气将生理盐水排净。实验时取不同浓度的供试液(预热至37℃)200 mL,先以1.0 mL·min-1的流速灌流10 min,再将流速调为0.2 mL·min-1,预平衡30 min后,于30~60、60~90、90~120、120~150 min时间段收集灌流液样品。取样品0.5 mL测定酚红浓度,其余样品立即酸化后,经0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液进样,测定峰面积,计算各个时间段灌流液样品中瑞香素的含量。采用上述实验方法分别考察瑞香素浓度、pH、肠段及P-gp等各因素对瑞香素肠道吸收的影响。最后剪取各个被灌流的肠段,测量肠内径以及长度。 灌流液中酚红浓度的测定 取含瑞香素对照品和酚红的K-R试液、不含酚红的瑞香素的K-R试液以及含酚红的K-R试液各0.5 mL,加入1 mol·L-1NaOH溶液1 mL、K-R试液3.5 mL,摇匀,于400~700 nm进行可见光扫描,确定测定波长及方法的专属性。采用K-R缓冲液配制含酚红10、20、30、40、50 mg·L-1的系列标准液,分别吸取0.5 mL,加入1mol·L-1NaOH溶液1 mL、K-R试液3.5 mL,摇匀,测定吸收度,以酚红质量浓度(C,mg·L-1)对吸收度(A)进行线性回归,得标准曲线方程。取酚红质量浓度为10、30和5