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代谢组学研究进展 1 在生物标记物中的应用 代谢组学是一种新的基础研究概念、遗传因素组学和蛋白质组学。在对特定基因或环境条件进行评估和干预后，考虑到生物因素的变化，它是研究生物体所有代谢方法的新技术。其研究对象主要是相对分子质量1 000以下的内源性小分子。与其他组学相比,它更能真实反映机体系统的生理和病理状态,为正在进行的生物过程提供一种瞬时的、综合的快照。在英文文献中,Metabonomics和Metabolomics均指代谢组学,前者一般以生物体液和组织为研究对象,Nicholson将其定义为定量分析生物体因病理生理刺激或基因改变引起的代谢应答变化;后者则侧重以细胞为研究对象,Fiehn将其定义为定性、定量分析单个细胞或单一类型细胞株的代谢调控和代谢流中所有低分子量的代谢产物。在Metabolomics研究中,根据研究对象和目的不同,Fiehn首次将代谢组学划分为靶向分析、代谢轮廓分析、代谢组学分析和代谢指纹分析四个层次。在其研究基础上,Kell等提出了代谢足迹分析,即细胞外代谢物分析,进一步扩大了代谢组学的研究范围;随后,Villas-Boas等又将代谢组学划分为靶向分析和代谢轮廓分析两类,后者包括代谢指纹分析和足迹分析。 恶性肿瘤是一种多因素参与造成机体各系统功能平衡紊乱的复杂疾病,导致机体病理生理过程变化,最终引起代谢组的改变。研究表明癌细胞具有一种独特的、有别于正常细胞的代谢表型,利用代谢组学技术在给定的时间和条件下可监测正常细胞及癌细胞代谢过程中所有小分子代谢物的波动情况,将有利于预测肿瘤的进展、了解体内物质代谢途径、探索癌症发病机制及药物作用机制等,再结合多种化学模式识别方法,从而发现与特定肿瘤相关的生物标记物。此外以人癌细胞为研究对象还可避免物种差异引起的误差、降低实验成本、减少实验时间,有望实现通过其特征性生物标记物进行癌症的早期诊断。本文对代谢组学研究中的细胞样品前处理方法及细胞层面的代谢组学研究进展做相应的论述。 2 样品前处理的必要性 代谢组学主要是对特定条件下或某一时刻细胞内代谢物进行的分析,因细胞内酶系活跃、代谢转换迅速,取样和样品制备方法显著影响分析结果的准确性、重复性。因此,做好样品的前处理是取得可靠分析结果的先决条件。根据研究对象、目的和分析技术的不同,对样品的前处理要求也不一致,不存在一种普适性的方法,样品处理方法大致分为两步:细胞淬灭和代谢物提取。 2.1 细胞内开代剂的应用 淬灭也称为“灭活”,目的是让细胞内的酶失活,保证代谢物的轮廓“冻结”。对于胞内代谢物,由于采样或脱离培养环境后细胞内代谢状态的变化,造成代谢物种类及含量也随之发生变化,为了正确反映培养环境中细胞代谢物的真实信息,需要立即淬灭细胞,终止胞内反应。理想的淬灭技术应在保持细胞完整性的基础上确保酶迅速失活。淬灭方法包括液氮冷冻法、酸碱灭活法、快速过滤法、低温离心法、细胞刮法、冷甲醇法等。Dettmer等采用低温离心法及细胞刮法淬灭多种贴壁哺乳细胞,结果发现低温离心可引起细胞内大量代谢物的泄漏,不适于代谢组学研究,而细胞刮法较为理想;Lorenz等建立了快速、简便的液氮冷冻法,在INS-1细胞代谢谱的研究中取得了理想效果。Teng等通过17α-炔雌醇引起的乳腺癌细胞代谢谱变化对甲醇淬灭法进行了评价,结果表明该法快速、简便,比传统淬灭法的提取率高50倍。Sellick等以悬浮培养的中国仓鼠细胞为对象,考察了60%冷甲醇(-40℃)、60%甲醇-70 mmol·L-1羟乙基哌嗪乙硫磺酸(p H7.4)、60%甲醇-0.85%碳酸氢铵(p H 7.4)、60%甲醇-0.85%Na Cl的淬灭效果,并采用多种分析方法测定了培养液、细胞提取液及清洗液中的多种组分来考察代谢物泄漏程度,结果表明60%甲醇-0.85%碳酸氢铵淬灭法泄漏程度最小。自1974年Weibel报道了一种能够在短时间内完成取样、淬灭和胞内代谢物提取的快速取样技术以来,该法在悬浮培养的哺乳动物细胞中也得到了迅速发展,并已成功应用于代谢组学研究中。Volmer等以悬浮细胞为研究对象,对多种采样方法进行了评价,结果表明快速过滤法处理效果较佳,具有快速、高效、重现性好、无偏向性等优点,并可直接应用于大量生物样品的分析。 研究发现,淬灭过程会导致泄漏即细胞内代谢物的丢失,且泄漏的程度与淬灭时间、温度及加入的淬灭试剂量等有关;随着淬灭剂的加入、淬灭时间减少、离心速度加快,泄漏程度会减轻。既然代谢物泄漏在所难免,在进行样品前处理时应尽量将泄漏的影响降到最低,并注意平行操作,快速淬灭后,迅速低温离心收集样品。另外,由于受细胞种类或分析技术的影响,不同淬灭方法效果可能存在差异,在实际应用中应做全面考察,选择最佳淬灭方法。 2.2 金融抑制因子及代谢中的金属酶 一旦代谢反应通过灭活