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藏族线粒体dnad-环区遗传多态性分析 人类骨骼dna（美国高碱基突变率和多胞胎血浆数量的遗传特征，对人类骨骼的遗传和进化研究具有重要意义。mtDNA的非编码区(D-环区)是研究人类群体遗传和进化的理想遗传标记,被广泛地应用于人类遗传学和法医个体识别。而西藏藏族mtDNA D-环区多态性的研究尚未见全面报道,本研究以那曲藏族为研究对象,观察mtDNA的遗传特点,为研究藏族起源提供遗传学证据,也为法医鉴定提供mtDNA序列多态性的基础数据。 1 材料和方法 1.1 样本 36例藏族样本均采自西藏那曲地区,每个提供样本的无关个体均身体健康,并追溯到3代以上家族史,EDTA抗凝。 1.2 ttg-34.5和4.34.34.5和4.34.34.34.34.34.34.34.34.54.54.54.5.4基因表达对交通网络的生长 扩增HVR-Ⅰ引物序列:F15997 5′-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3′ R16401 5′-TGA- TTTCACGGAGGATGGTG-3′。Wizard PCR Pres DNA Purification System(美国Promega公司)。Big Dye Terminator Sequencing试剂盒(美国ABI公司)。 1.3 仪器 PCR扩增仪(Hybaid)ABI Alvant 3100自动测序仪(ABI公司,美国)。 1.4 提取和定量d 酚-氯仿法提取DNA,并用紫外分光光度计测定OD260、OD280,以测定DNA的含量和纯度。 1.5 pcr扩增taq酶 扩增体系为50μl,样本10ng,引物各0.5μmol/L,dNTPs 200μmol/L,MgCl21.5mmol/L,10×缓冲液5μl,Taq酶0.3U(Promega公司)。扩增程序:变性94℃ 4min;退火55℃ 40s;延伸72℃ 40s 10min,共35个循环,最后72℃延伸10min。扩增产物用Pres DNA Purification System试剂盒纯化。荧光法测序。 1.6 变异位点的发现 使用Clustal W比对软件将各个体的序列分别与Anderson序列比较,发现并统计变异位点。按照公式P=∑X2(X为每个个体单倍型频率)计算偶合概率,公式h=(1?∑X2)n/(n?1)(n为样本含量)h=(1-∑X2)n/(n-1)(n为样本含量)计算基因变异度。 2 结果 2.1 碱基转换及创性变化 对西藏藏族群体36个无关个体HVR-Ⅰ行测序,发现34种不同的单倍型。Anderson序列是当前国际上普遍应用的mtDNA的标准序列,各序列与其比较,共发现有51处突变部位,碱基转换141个,占碱基突变的89.81%,其中G-A突变10.19%,A-G突变12.74%,C-T突变38.85%,T-C突变28.03%;碱基颠换9个,占碱基突变的5.73%,其中A-C突变5.10%,C-G突变0.63%。碱基插入1.91%,碱基缺失2.55%。突变的热点部位出现在16223、16362,其突变频率分别为83.33%、58.33%(附表)。 2.2 个体序列多态性 由于np16189位出现T-C碱基转换,在16180-16194区域出现C重复(poly-C),其长度及序列由于受到碱基插入、缺失、转换、颠换等影响,个体之间出现序列多态性。本研究形成9种单倍型,其中AAAACCCCCTCCCCA(24个),AAAA- TCCCCTCCCCA(2个),AAAACTCCCTCCCCA(2个),AAAACCCCCTCCCCG(1个),AAACCCCCCTCCCCA(2个),GAAACCCCCTCCCCA(1个),AACCCCCCCCCCCCA(2个),AAAACCCCTCCCCCA(1个),AGAACCCCCTCCCCA(1个),合计36个。 2.3 对纳曲藏族mtd-环区基因的基因变异度和偶合概率的分析，我们计算了h.0.9931和h.0.0316 3 藏族群体的遗传多样性 藏族是我国少数民族之一,世代生活在平均海拔4000m的青藏高原上,由于青藏高原封闭的 地理环境和藏族婚俗的对外隔离性,使这一群体形成显著的遗传学隔离,是研究藏族人群起源和迁移规律及其与我国其他民族之间亲缘关系的良好资源。本研究对西藏那曲藏族mtDNA的多态性进行分析,以期研究藏族与其他民族或种族的亲缘关系,以及探讨mtDNA的多态性用于藏族群体的个体识别的可能性。 本研究发现,藏族个体mtDNA碱基突变的主要形式为碱基转换,热点突变主要集中在np16223及np16362位置,这两处碱基在藏族(83.3,58.3)、中国汉族(62.5,44.2)、日本人(73.8,42.6)、朝鲜人(78.4,38.6)群体中有比较高的突变率,而在法国(