氧化型谷胱甘肽的制备.docxVIP

氧化型谷胱甘肽的制备 自由氨基酸是身体的正常代谢产物，具有很强的氧化反应能力。过量的自由基会对蛋白质、核酸等造成损伤,从而引起相关疾病。谷胱甘肽是细胞内的天然抗氧化剂,参与完成对自由基(主要为氧自由基)的清除,其自身则被氧化成为氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG,1)。1在谷胱甘肽还原酶的作用下被还原为还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH,2),使体内两种形态的谷胱甘肽维持动态平衡。2由于其显著的保肝作用,已广泛用于药物性肝损伤及其他肝脏疾病的临床治疗。金春英等报道1对2清除自由基具有协同作用。作为免疫增强剂,1已于2005年在俄罗斯批准上市(商品名Glutoxim?),用于化疗、放疗和抗感染联合用药。本研究考察了以2为原料制备1的工艺,并研究了1对小鼠急性肝损伤的治疗作用。 1 中药-中酰氨基酚试剂 515-2487型高效液相色谱仪(美国Waters公司)。 2原料(美国Amresco公司,含量98.2%,批号1467B509);1二钠盐对照品(美国Sigma公司,含量99.1%,批号085K7435);注射用2(重庆药友制药有限公司,规格1.2 g,批号1005030);对乙酰氨基酚(3,含量98.4%,批号、过氧化氢(中国医药集团化学试剂公司);谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);其他试剂均为分析纯。 雄性ICR小鼠[体重18~20 g,上海斯莱克实验动物有限责任公司,实验动物生产许可证SCXK(沪)2007-0005]。 2 方法和结果 2.1 总过氧化氢检测磷酸二氢钠溶液 色谱柱TSKgel ODS-100V柱(4.6 mm×250 mm,5uf06dm);流动相0.025 mol/L磷酸二氢钠溶液(pH 3.15);柱温30℃;流速1 ml/min;检测波长210 nm;进样量20uf06dl。分别取1二钠盐对照品和2原料适量,用水溶解制成1 mg/ml的溶液1和溶液2;量取过氧化氢溶液适量并用水稀释得浓度为0.06%的溶液3。将溶液1、2和3等体积混匀得混合溶液,在本色谱条件下的色谱图见图1,可见三者分离度良好。 2.21 制装剂的研究 2.2.1 过氧化氢用于氧化 配制200 g/L的2溶液,共5份。将其中1份直接加水稀释至150 g/L,测得pH为3.0。其余4份加5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH为4.0、5.0、6.0和7.0,然后加水使其终浓度为150 g/L。每份取10 ml于冰浴下以120 r/min搅拌10 min,滴加30%过氧化氢1 ml,反应0.5、1、1.5和2 h后取样并立即稀释150倍进行HPLC分析,计算1的峰面积百分比。试验重复3次,结果见表1。 结果表明,当过氧化氢终浓度为3%时,在pH5~6条件下对2的氧化效率较高。在中性条件下,氧化反应不彻底,推测其原因为过氧化氢在中性条件下易分解,导致反应体系中氧化剂的量降低。 2.2.2 过氧化氢对样品的氧化速度影响 取2 20 g,加水30 ml溶解,搅拌并滴加5 mol/L氢氧化钠溶液调至pH 5.1,补加水至总体积为40 ml并均分成4份。将其中3份的浓度稀释至400、300和200 g/L,复测pH并将之调节为5.1。各份样品置冰浴中,照“2.2.1”项下加入过氧化氢进行反应并测定。试验重复3次,结果见表2。 可见在过氧化氢浓度一定时,2浓度对氧化速度有较大影响。2浓度小于300 g/L时,由于过氧化氢相对更加过量,在2 h内就能氧化完全。在高浓度(400 g/L以上)时,虽然进一步增加过氧化氢浓度可能加快反应效率,但综合考虑2的溶解度、反应体系的体积和后处理,及过氧化氢的用量等因素,在制备1时反应物浓度为300 g/L较合适。 2.2.3 过氧化氢用于合成其他双环[3.2.2] 取2 10 g,加水30 ml溶解,搅拌并滴加5 mol/L氢氧化钠溶液调至pH 5.5,补加水至总体积为40 ml并均分成4份。冰浴下搅拌10 min后分别加入30%过氧化氢0.5、1、2和3 ml,即过氧化氢终浓度分别为1.5%、3%、5%和7%。继续搅拌反应并照“2.2.1”项下方法取样测定。试验重复3次,结果见表3。 结果显示,pH为5.5、2浓度为250 g/L时反应速率与过氧化氢的浓度呈正相关。采用终浓度3%可最大量地节约过氧化氢用量和反应时间。 2.2.4 无水乙醇用量的制备 将“2.2.3”项下过氧化氢终浓度为3%、5%和7%并反应2 h的三组反应产物合并,得1溶液约30 ml,缓慢加入无水乙醇100 ml,搅拌得白色1沉淀。过滤,滤饼再加入无水乙醇100 ml,搅拌5 min后过滤,重复3次以充分去除过氧化氢和水分