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铜对草鱼肝脏中谷胱甘肽的影响 在代谢过程中，污染物会产生许多生物反应（ros），导致过氧化，对需氧生物的潜在毒性影响。必须尽快清除。还原性氨基葡萄糖（gsh）是生物中的重要活性物质。它不仅可以用作谷神经激素（pgx）和谷神经激素硫旋酶（gst）的物质，而且可以直接结合在一起。它在解毒和代谢生物体中发挥着重要作用。报道了国外在水生生物暴露条件下对gsh的变化进行的研究，但在国内研究相对较少。 谷胱甘肽还原酶(GR)是一种黄素蛋白氧化还原酶,在不同的胁迫反应中有不同的作用.GR的表达能导致叶片中谷胱甘肽的水平倍增.在氧化胁迫反应中,它对保护细胞内谷胱甘肽库大部分处于还原状态起关键作用.谷胱甘肽必须以还原形式GSH来完成许多功能,尤其是在清除活性氧中介如过氧化物、过氧化氢等氧化剂中起重要作用,如果活性氧不被清除,将直接或间接地通过脂质过氧化的产物引起细胞组分(如酶、DNA、膜)发生破坏. GSH在γ_谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的连续作用下合成,又可在谷胱甘肽还原酶(GR)的作用下由氧化型谷胱甘肽(GSSG)转化而来. 铜是水环境中重要的污染物之一,对水生生物的毒性很强.而低剂量铜暴露因其接近现实,更应该引起关注.通过测定水生生物特定的生理生化指标来确定污染的存在与否是十分必要的. 本文通过铜及其配合物低浓度长期暴露后对鲫鱼肝脏谷胱甘肽系列的影响,探讨Cu2+的致毒机理以及有机配体的加入的影响. 1 材料和方法 1.1 试剂和仪器 紫外可见分光光度计(北京瑞利)、Microfuge22R高速冷冻离心机(美国Beckman公司).硫酸铜、EDTA二钠盐均购自Amerco公司,其余试剂均为国产分析纯. 1.2 区域主养试验型. 彭泽鲫鱼(Carassius auratus)购自南京市水产研究所禄口养殖基地,其平均体长为(7.10±0.65) cm,平均体重为(5.32±0.045) g.驯养采用除氯自来水,水温为(16.0±1.0) ℃,实验前驯养14 d,死亡率小于5%.随机选取个体差异不大、健康活泼的鲫鱼用于暴露试验. 1.3 cuedtacu 在40 L水族箱中分别加入20 L试验溶液,每组投8尾鲫鱼,暴露时间为40 d.Cu2+暴露浓度分别为0、0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.25、0.75 mg/L,Cu_EDTA处理根据MINTEQ程序,按照与Cu2+有99%络合率,加入EDTA二钠盐溶液,并设对照.采用静态置换法,每天更新溶液50%,每天投颗粒状饵料一次. 1.4 gsh含量的测定 40 d后,活体解剖,取出肝脏,迅速置于液氮中,-80 ℃低温保存.测定时,加10倍体积预冷的缓冲液,冰浴下匀浆,4 ℃冷冻离心(10 000 r/min转速冷冻离心10 min),上清液用于样品测定. 1.4.1蛋白质测定用Bradford方法测定,见文献. 1.4.2 GR活性测定反应体系中含1 mol/L EDTA, 1 mol/L GSSG, 0.2 mol/L NADPH, 0.1 mol/L PBS(pH 7.8)及酶样上清液. 1.4.3 GSSG含量的测定 1.4.4 GSH含量的测定参照Cohn 和Lyle的方法,略做改动.最终的反应体系中含2.8 mL的0.1 mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液[pH 8.0,c(EDTA)=0.005 mol/L],100 μL稀释上清液和100 μL OPT(2 mg/mL甲醇).混匀后于室温15 min测定,激发波长350 nm,发射波长420 nm,通过标准曲线计算GSH含量(μg/g). 1.5 数据处理方法 实验数据进行统计学处理.所获的结果均为平均数±标准误差(Mean±SD)表示,并用单因素方差分析方法和单边t检验法,对组间数据进行差异性显著分析,P≤0.05,被认为是差异显著. 2 结果与讨论 2.1 cu2+对gr活性的影响 EDTA配合物对鲫鱼肝脏谷胱甘肽还原酶(GR)活性的影响图1为Cu2+及Cu_EDTA对鱼体肝脏中谷胱甘肽还原酶的影响随浓度不同的变化.与对照组相比,在暴露浓度均为0.002 5 mg/L时,两种形态铜离子对GR基本无影响.暴露在Cu2+浓度0.005 mg/L中的谷胱甘肽还原酶活性被轻微地激活,而暴露于相同浓度Cu_EDTA中则被显著抑制(P≤0.05).当暴露浓度大于0.01 mg/L时,Cu2+对GR活性的影响随浓度增大抑制程度加深,0.25 mg/L处理组与对照相比,差异显著(P≤0.05);而暴露于Cu_EDTA中的鱼肝GR活性却有激活的趋势,0.01 mg/L组与对照相比有显著差异(P≤0.05). 2.2 cu2+及cuedta对人体gssg含量的影响 实验结果见表1,从表1中可看出,Cu2+