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浊点萃取液-液萃取方法的研究进展 一、 高效液相色谱前处理 云萃取方法（cpe）是近年来提出的一种新兴的液相萃取技术。使用具有机械溶剂不会影响环境。它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础, 改变实验参数引发相分离, 将疏水性物质与亲水性物质分离。目前, 该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中。它经济、安全、高效、操作简便、应用范围广。作为分离纯化方法, 易于大规模生产;作为样品前处理方法可与高效液相色谱 (HPLC) 、流动注射分析 (FIA) 等后序仪器分析方法联用。 本文概述了CPE的原理、操作方法, 总结了CPE近年来在生物大分子的分离及分析方面的应用, 讨论了与其他液-液萃取法的区别, 还探讨了该法的发展前景。 二、 浊点提取的基础 1. 浊点现象—表面活性剂胶束溶液的形成和浊点现象 表面活性剂分子通常由疏水和亲水两部分组成。疏水部分在水溶液中聚集成核, 亲水部分向外张开形成胶束。表面活性剂在水溶液中形成胶束的最小浓度称为临界胶束浓度 (CMC) , 最低温度称为临界胶束温度 (CMT) 。表面活性剂类型不同, 溶液条件不同, 胶束形态各异, 如圆形、椭圆形、圆柱形。 平时应用表面活性剂性质最多的是它的增溶作用, 很多微溶于水或不溶于水的物质可以与表面活性剂结合后溶于水。CPE法除了利用增溶作用外, 还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。一个均一的表面活性剂水溶液在外界条件 (如温度) 变化时, 因为引发相分离而突然出现浑浊的现象叫浊点现象, 此时的温度叫做浊点温度 (CP) 。静置一段时间 (或离心) 后会形成两个透明的液相:一为表面活性剂相 (约占总体积的5%) ;另一为水相 (胶束浓度等于CMC) 。外界条件 (如温度) 向相反方向变化, 两相便消失, 再次成为均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白, 与表面活性剂的疏水基团结合, 被萃取进表面活性剂相, 亲水性物质留在水相, 这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。温度的改变, 引起水化层的破坏, 增强了表面活性剂的疏水性。相分离是熵 (倾向于水与胶束相溶) 与焓 (倾向于水与胶束相分离) 竞争的结果。 浊点萃取中表示表面活性剂胶束溶液浓度与浊点温度变化关系的相图, 对不同体系其形状各不相同。相图上的曲线也是其两相的共溶曲线。图2A为非离子型表面活性剂胶束溶液的相图, 温度-浓度曲线把图分为两部分, 上部为双相区 (2L) , 下部为单相区 (L) 。曲线的最低点对应的浓度与温度分别为表面活性剂的CMC和CMT。图2B为两性离子表面活性剂胶束溶液的相图, 温度-浓度曲线同样把相图分为两个区域。不同的是上部为L下部为2L。这就意味着温度升高两相消失, 温度降低至浊点以下, 两相又出现。与非离子型表面活性剂恰好相反, 两相的出现是由于温度下降而不是温度升高引发的。 2. 其他表面活性剂 研究影响浊点萃取常用的参数包括:表面活性剂的浊点 (CP) 、萃取率 (E) 、浓缩因子 (CF) 和分配系数 (K) 。 它们可用下式表示:E=CS×VS/ (CO×VO) =CF×VS/VO;CF=CS/CO;K=CS/CW。其中CS为溶质在表面活性剂中的浓度,CO为萃取平衡后溶质在原始溶液中的浓度,CW为溶质在水相中的浓度,VS为表面活性剂的体积,VO为原始溶液的体积。影响浊点萃取的因素很多, 简要概括如下: (1) 表面活性剂类型及性质 选择表面活性剂时主要考虑其两个性质:①浊点温度, 尤其对于热敏感的分析物要注意操作温度对稳定性的影响;②疏水性, 疏水性太强会造成蛋白质失活。 表1中列出了CPE中常用的表面活性剂名称、结构和浊点温度以及它们的临界胶束参数。浊点温度与表面活性剂中亲水、疏水链长有关。疏水部分相同时, 亲水链长增加,CP升高;相反, 疏水链长增加,CP下降。表面活性剂浓度增加,E随之增加达到最大值。 (2) 添加剂的加入 在生物大分子的浊点萃取中, 特别是对热敏感的生物大分子, 需要使用CP较低、疏水性适宜的表面活性剂。很多添加剂如电解质、有机物、表面活性剂、蛋白质变性剂等都可在很大范围内影响表面活性剂的CP, 引发表面活性剂水溶液的相分离。 可以加入的电解质种类很多。在非离子型表面活性剂中加入氯化物、硫酸盐、碳酸盐、叠氮化物等盐析型电解质, 可使胶束中氢键断裂脱水, 导致表面活性剂分子沉淀从而降低表面活性剂的CP, 引发相分离。引发相分离的盐浓度与表面活性剂的疏水性有关, 疏水性强需要的盐浓度低。在大多数实验中要加入NaCl, 一方面降低CP温度, 另外缩短相分离时间。盐浓度增加可以使E和CF提高, 但要避免过高盐浓度以免对