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一例羊传染性脓疱病毒分子特征分析 绵羊感染（通常称为羊口伤口）是由痘病毒科引起的。副痘病毒是由羊感染脓毒者引起的人类感染。 该病主要危害3~6 月龄羔羊和部分成年羊,羔羊发病率可高达100%,临床症状表现为嘴唇、口黏膜部分皮肤红疹、脓疱、溃疡和结痂;羔羊表现为齿唇部破溃,不能吃奶,若继发或混合感染其他病原微生物死亡率较高。该病世界范围内发生,且广泛流行,近年来随着肉羊产业的发展和羊频繁流动,该病时有发生,给养羊业带来了巨大的经济损失。 羊口疮在我国部分地区暴发和流行,严重危害肉羊产业的健康发展。如2005年3月广西马山县、2005年4月山西省保德县、2005年9月甘肃省山丹县,2006年7月吉林省松原市,北京市和江苏省淮安市曾报道有该病的发生。更为严重的是此病可以通过伤口感染饲养人员,表现为手背、指间和前臂部疱疹和破溃。例如2005年8月福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病。因此,羊传染性脓疱不但严重危害肉羊产业的健康发展,而且威胁人类的身体健康,是一种危害较为严重的人畜共患传染病。 单独依靠临床症状进行该病的诊断具有一定的不准确性,病毒分离鉴定虽然是诊断羊传染性脓疱的金标准,但是因耗时长而制约了临床应用,电镜观察和PCR技术具有速度快、灵敏度高等特性而被广泛应用。ORFVB2L基因作为主要免疫原性基因常被用来进行病毒的鉴定和遗传进化关系分析。作者对2009年发生于湖北地区某羊场疑似羊口疮病料进行了病毒电镜观察,病理切片染色、特异性基因(B2L)扩增以及基于B2L基因序列的遗传进化关系分析。 1 材料和方法 1.1 复配 采集自2009年湖北某羊场疑似羊口疮黑山羊的唇部痂皮,加无菌PBS(pH7.2)和适量灭菌石英砂研磨制成1∶10 悬液,反复冻融3次后5 000 r·min-1离心30 min 取上清。上清中加入3%氯化钠(质量比)和15%PEG(体积比)4 ℃搅拌过夜后,12 000 r·min-1离心30 min,沉淀用1/10体积(离心前体积)PBS溶解。 1.2 病理切开物和散列 取适当大小的痂皮块按常规方法进行石蜡切片、HE染色和显微镜观察。 1.3 病毒粒径形态观察 取适量1.1中最后溶解上清悬液滴加到覆盖有Formvar膜的铜网上,吸附5 min后用滤纸将铜网上的病毒悬液吸去,待Formvar膜干燥后滴加20 g·L-1磷钨酸染色1 min,然后用滤纸将磷钨酸吸去,待铜网干燥后用P62-JSM-6390LV型号电子显微镜观察病毒粒子形态。 1.4 引物的筛选 根据GenBank公布的参考序列(GQ328006)设计羊ORFVB2L基因特异性扩增引物,上游引物为5′-AAAGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCAT -3′,下游引物为5′-AAACTCGAGTTAATTTATTGGCTTGCAGA-3′。为便于该基因后续表达,上游引物引入BamHⅠ酶切位点(下划线部分),下游引物引入XhoⅠ酶切位点(下划线部分)。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。 1.5 pcr扩增 取1.1中沉淀后溶解上清500 μL,按DNA快速提取试剂盒方法提取总DNA,取5 μL作为模板,反应体系为EX DNA polymerase(5 U·μL-1)0.25 μL,10×buffer 5 μL,dNTP mixture(各2.5 mmol·L-1)4 μL,上游引物20 μmol·L-11 μL,下游引物20 μmol·L-11 μL,灭菌蒸馏水33.75 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,56.5 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。扩增结束后,取反应液5~10 μL,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。 1.6 质粒提取和鉴定 目的基因经DNA凝胶回收试剂盒回收后和T-Vector连接,连接体系为T4 DNA ligase 1 μL, T4 DNA ligation buffer 3 μL,目的基因5 μL,T载体1 μL,16 ℃过夜连接;连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌,涂Amp抗性平皿后提取质粒经酶切和PCR鉴定命名为T-B2L。将鉴定正确的质粒进行序列测定,并提交GenBank。收集GenBank公布的其他毒株B2L基因序列(详细信息略),使用DNAStar、Mega4.0软件进行氨基酸序列同源性分析和遗传进化关系分析。 2 结果 2.1 电镜观察 处理病料,经磷钨酸负染后在电镜下观察可见直径150~200 nm、卵圆形、有囊膜的病毒颗粒(图1)。 2.2 病理人类学 制备病理切片,进行HE染色,显微镜下观察可见表皮层肿胀,组织间有大量炎性细胞浸润(图2)。 2.3 基因扩增 PCR扩增结束后,取产物进行0.