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羊口疮的流行病学诊断 羊口炎（orf）也被称为羊感染败血症、羊感染败血症和羊感染败血症。它是由痘病毒科和假磺酸钠（环磷酰胺）引起的。这是一种严重的共济肿性传染病，对山羊和绵羊也有影响。临床上以患羊口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及结成疣状厚痂为主要特征。该病传播迅速,流行广泛,发病率高,对所有品种、不同性别和不同年龄羊只均可感染,其中以3月~6月龄羔羊更易感,病死率较高。羊口疮在养羊的国家和地区普遍发生,常呈群发性流行,是严重威胁养羊业,具有重要经济意义的病毒病。笔者对贵州省的5个养羊大县(晴隆县、关岭县、赫章县、开阳县和大方县的养羊场(户或合作社)的羊只进行了羊口疮的流行病学调查与实验室诊断,现报告如下。 1 权利不良对羊口胞的感染 通过流行病学调查,在贵州的5个养羊大县都有羊口疮的流行,发病率为2.2%~17.7%,病死率为0~51.4%;任何年龄的黑马羊、沿河黑山羊、麻江黄羊和外地引进的波尔山羊均可感染羊口疮,无性别和品种差异。以3月~6月龄羔羊发病最多,成年羊同样易感,多发生在购入病羊或带毒羊15d以后。本病一年四季均可发生,但最常发生于初春或者春末夏初,气候炎热,干旱及枯草季节。病羊和带毒羊为主要传染源。自然感染主要因购入病羊或带毒羊传入健康羊群或者是通过将健羊置于曾有病羊用过的厩舍或污染的牧场而引起。 2 组织病理学检测 根据发病时间,可分为四阶段:首先在口角、唇部、鼻镜乃至耳廓上长出散在小的突起;小的突起慢慢长大、增多,蔓延到整个口的周围及颜面;这些突起变红,形成水泡和脓疱,继而连成一片;结痂、龟裂,结痂下面有肉芽组织增生,有的嘴唇外翻,形成桑葚状痂垢(图1)。严重者水疱从舌的前端向后蔓延,直到喉咙(图2),羔羊无法采食,精神高度沉郁,乃至危及生命。根据发病的部位可分为唇形、乳房型(图3)、外阴型(图4)和混合型。其中以唇形较为常见。 3 疾病的病理改变 3.1 嘴唇外翻结构 病死山羊尸体十分消瘦。其唇周痂皮下有肉芽组织增生,呈鲜红色,整个嘴唇外翻呈桑葚状突起,口腔内有水疱、溃疡和糜烂,脓疱破溃后,成黄色或棕色的疣状结痂,舌根、喉头、咽部等部位红肿,颌下淋巴结肿大。胃肠几乎无内容物,其他内脏器官未发现明显病变。 3.2 细胞破壁与细胞间染色法检测细胞的活性 选取有病变的口唇部位,用100mL/L的福尔马林固定组织24h后,流水冲洗一夜,常规脱水、透明、石蜡包埋、制备5μm切片,进行苏木素-伊红(HE)染色,通过显微镜观察,可见细胞发生“气球样变”(图5)。“气球样变”的细胞破裂,与细胞间脓性水肿液融合成水疱或脓疱。并可见到出血现象(图6)。 4 病变检查 4.1 微织物染液的制备 采取疫区的疑似病料研磨成病料悬液,5 000r/min离心30min,上清液用0.45μm滤膜过滤,滤液采用30g/L戊二醛固定后滴于铜网上5min,再滴加10g/L磷钨酸染液负染2min,将多余的染液吸干,在电镜下观察。可见病料悬液中有完整、堆积的OrfV,也有单在、破碎的病毒粒子,呈卵圆形线团样,表面呈绳索样缠绕结构,大小为150nm~200nm×230nm~260nm,粒子外有被膜包裹(图7,图8)。 4.3 pcr扩增条件 根据GenBank中OrfV的全基因序列,选择较保守的H2L基因设计1对引物。P1:5′-CGA ACT TCC ACCTCA ACC ACT CC-3′,P2:5′-CCT TGA CGATGT CGC CCT TCT-3′,预计扩增目的片段大小为507bp,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR反应采用50μL反应体系:10×PCR Buffer(含MgCl2)5μL,dNTPS(10mmol/L)1μL,TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)1μL,上下游引物(10pmoL/μL)各2.5μL,DNA模板1μL,灭菌双蒸水(dd H2O)补足至50μL。 扩增条件为:94℃预变性5 min;94℃1 min,55℃1min,72℃1min,34个循环;72℃延伸10min。扩增产物用10g/L琼脂凝胶(含8g/L的赛百盛GOLD VIEWTM),以80V电压在1×TAE的缓冲液中电泳20min。凝胶成像系统观察结果(图9)。 由图9可见,5份待检病料提取的DNA样本,经PCR扩增后,均扩增出一条约507bp的特异性条带,大小与阳性对照株相同,而阴性对照无扩增条带。 5 分离株的筛选及病理变化 根据流行病学调查、临床症状、病理剖检变化可对该病作出初步诊断,经病理组织切片观察、电镜负染和PCR对该病进行了确诊。贵州省的5个养羊大县(晴隆县、关岭县、赫章县、开阳县和大方县的养羊场(户或合作社)均有羊口疮的流行。 本病在世界许多国家和地区均有发生,南非、澳大利亚、新西兰、希腊、土耳