胶束萃取-高效液相色谱法测定葛根粉中异黄酮类化合物.docxVIP

胶束萃取-高效液相色谱法测定葛根粉中异黄酮类化合物 葛根是豆科植物野葛的干燥之根，通常用于中药。根据现代研究，葛根的主要有效成分是异黄酮类化合物，如葛根素。这种化合物具有抗氧化性，能改善心脏、大脑血液循环、冠状动脉扩张、降压、降血糖等症状。葛根又属于药食同源,也广泛地被应用于保健食品和食品中。有关葛根中葛根素等异黄酮的含量测定研究已有不少报道,但对市售的葛根粉中葛根素含量测定报道不多,本实验针对葛根粉中葛根素等异黄酮的提取、预富集条件以及测试条件等进行优化,并采用高效液相色谱法对葛根粉样品进行定量分析。 测定中草药葛根样品中的异黄酮含量通常采用高效液相色谱法、高效薄层色谱法和红外光谱法等,其样品前处理常采用液-液萃取法、索氏萃取法和固相萃取法,这些方法都使用大量的有机溶剂,费时耗力而且在蒸发浓缩过程中有部分被测物丢失。胶束萃取(micelle-mediated extraction,MME)和浊点萃取(cloud point extraction,CPE)预富集方法是近年来发展起来的一种特殊液液萃取分离技术,它是利用表面活性剂胶束水溶液的增溶性和浊点现象,改变实验参数引发相分离,可以使表面活性剂结合的疏水性物质与亲水性物质达到理想的分离效果,从而可以提高回收率和预富集因子。与上述传统前处理方法比较,该方法只需要一定浓度的表面活性剂,具有试剂用量小、环境友好、萃取效率高、操作简便等优点,已广泛应用于环境样品、医药样品和固体样品的前处理中。 本实验拟以非离子表面活性剂Triton X-114为萃取剂,利用胶束萃取技术来提取、分离葛根粉中的葛根素等异黄酮类物质,应用反相高效液相色谱法(R P-HPLC)分析测定其含量,以期为评价葛根粉这一药食资源的质量提供参考依据。 1 材料和方法 1.1 中药现代化技术工程中心 葛根粉重庆市场。 葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素对照品天津中新药业中药现代化技术工程中心;甲醇(分析纯)成都市科龙化工试剂厂;冰乙酸(分析纯)重庆东方试剂厂;氯化钠、硫酸钠、碳酸钠(均为分析纯)重庆北碚化学试剂厂;二次蒸馏水为实验室自制;Triton X-114深圳美荷生物有限公司。 1.2 仪器、试剂与仪器 LC-20AT液相色谱输液泵、SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、LC-Slution色谱数据处理系统日本Shimadzu公司;色谱柱为Phenomenex C18(150mm×4.6mm,5μm)广州菲罗门科学仪器有限公司;0.45μm针头微孔滤膜过滤器重庆钛新仪器有限公司;KH-3200B型超声波清洗器昆山禾创超声仪器有限公司;TGL-16G高速离心机上海安亭科学仪器厂;SZ-2自动双重纯化水蒸馏器上海沪西分析仪器;LIDA p H计上海理达仪器厂;FA2004A型分析天平上海精天电子仪器公司。 1.3 储备溶液的制备 对照品储备液:分别精密称取对照品葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素适量,加甲醇配制成葛根素273μg/m L、大豆苷100μg/m L、大豆苷元500μg/m L、染料木苷100μg/m L、染料木素160μg/m L的溶液,作为储备溶液,待用。 对照品混合溶液:精密吸取5种异黄酮储备液适量,用3g/100m L Triton X-114表面活性剂溶液配制成一系列浓度不同的对照品混合溶液,冰箱(4℃)内保存备用。 1.4 超声萃取工艺 胶束萃取:准确称量0.1g葛根粉样品,置15m L离心管中,加入10m L 3g/100m L Triton X-114水溶液摇匀后放入40℃超声水浴中超声萃取30min,萃取完成后3000r/min离心10min,将萃取上清液经0.45μm有机滤膜过滤后待用。 CPE富集:将上述萃取上清液转入10m L的离心管中,加入1.76g Na Cl旋涡振荡1min后,置入55℃恒温水浴中平衡40min,3000r/min离心5min使两相分离,弃去上层水相,分取下层表面活性剂富集相,用甲醇定容到1.0m L来降低表面活性剂的黏度,经0.45μm有机滤膜过滤后供高效液相色谱分析。 1.5 条件1 2 结果与分析 2.1 萃取剂种类对0.3g葛根粉提取含量的影响 为考察Triton X-114表面活性剂的提取效果,在相同的条件下,分别研究甲醇、5 0%甲醇、乙醇、环己烷、丙酮和正己烷6种常用萃取剂与3g/100m L Triton X-114非离子表面活性剂对0.1g葛根粉中5种异黄酮提取含量的影响。结果表明采用3g/100m L Triton X-114为提取溶剂,获得的葛根异黄酮类物质的提取量均为最大。 2.2 选择和优化胶束提取参数 2.2.1 tri能力表面活性剂的提取效果 分别考察质量浓度为1.5、3、4、6、12g/100m