慢性疲劳模型动物皮质超微结构改变及中药调节作用.docxVIP

慢性疲劳模型动物皮质超微结构改变及中药调节作用 在目前的慢性疲劳综合征（cps）研究中，建立更理想的慢性疲劳模型是研究的关键。为此我们在以前的实验中,结合CFS的发病及病理特点和我们对它的中医病机认识,使用慢性束缚法建立了较为理想的慢性疲劳动物模型。该模型大鼠在行为学实验中表现出典型的疲劳征象并伴有一些与CFS相关的其他行为学改变。在随后的研究中还发现该模型大鼠的一些中枢神经递质的分布与代谢发生了紊乱,这在一定程度上揭示了该模型大鼠的疲劳现象及其行为学改变的机制。本实验在运用慢性束缚塑造慢性疲劳动物模型的基础上,着重探讨了模型动物的肾上腺指数和肾上腺皮质的超微结构的改变及中药的调节作用。 1 材料和方法 1.1 实验动物 二级Wistar雄性大鼠,体重160～180 g,由中国医学科学院流行病研究所实验动物中心提供。 1.2 人参皂还药系统 消疲怡神口服液:由黄芪、枳壳、人参、柴胡、陈皮等药组成。委托北京永定制药厂加工,批号:960928。规格:10 mL/支,相当于每mL含生药1 g。 人参皂甙片:中美合资吉林省亚威制药有限公司生产,吉卫药准字,批号规格:0.1 g/片,含人参总皂甙25 mg/片。 1.3 试剂和设备 1.4 动物的分组与束缚 动物饲养于室温为(22±2)℃、正常光照的清洁级动物室中,5只/笼。适应2 d后,将45只大鼠随机分为正常对照组(A组,n=11);模型组(B组,n=11);模型加中药复方组(C组,n=12,简称中药复方组);模型加人参皂甙组(D组,n=11,简称人参皂甙组)。第3天开始造模,持续2周。造模期间,每天将B、C、D组束缚1次,每次束缚过程3组同步进行。每天束缚开始时间不同,随机确定。每次束缚时,使动物钻进束缚筒内,并调节到其不产生强烈反抗的紧张程度,平架在木板上。3 h后,3组动物同步取出。在整个束缚过程中,A组动物在同一环境中,同样不予以进食水。造模结束后,立即开始行为学的测定。 1.5 灌胃容积测定 每次开始造模前1 h给4组大鼠灌胃,连续两周。A、B组予以单蒸水,C组予以消疲怡神口服液(5 g/kg·d),D组予以人参皂甙片[配制成水溶液70mg/(kg·d)],各组灌胃容积均为3 mL。 1.6 左肾组织的测定 取材及样品处理:10%水合氯醛将大鼠麻醉(400 mg/kg)取血后,断头处死。在放有冰块的玻皿中迅速打开腹腔,取右侧肾上腺,置于2.5%戊二醛固定备用。再取左侧肾上腺称重,并记录。组织包埋与染色:将肾上腺皮质切成数块,每块大小约为1mm3,经俄酸处理,常规脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸双氧铀染色,电镜下观察肾上腺皮质超微结构。 2 结果 2.1 各组大鼠左肾指数、人参皂充指数的比较 经慢性束缚法造模2周后,模型组较正常组大鼠左侧肾上腺指数增加15.6%,中药复方组较正常组增加2.8%,人参皂甙组较正常组降低了0.1%(见表1)。 2.2 长期应激后肝肾皮质超微结构的变化 (1)正常对照组:大鼠肾上腺皮质束状带,其细胞核膜完整,核染色质分布均匀,核仁清晰,线粒体呈管状,不肿胀,嵴清楚,胞浆内脂质、脂滴清晰,丰富(见图1)。 (2)模型组:造模2周后,大鼠肾上腺皮质束状带,线粒体呈管状,疏松并有轻度肿胀,脂滴、脂质空泡较少(见图2)。 (3)中药复方组:服用消疲怡神口服液大鼠,肾上腺皮质束状带,胞浆丰富,脂滴、脂质空泡较多,线粒体结构接近正常对照组(见图3)。 (4)人参皂甙组:服用人参皂甙组大鼠,肾上腺皮质束状带,脂质、脂滴少于中药复方组,线粒体接近正常对照组(见图4)。 肾上腺皮质在应激过程中起着较为重要的作用,一般认为,其线粒体、滑面内质网与脂质是参与类固醇激素合成的主要细胞器。故它们的体积、数量和形态的变化在一定程度上反映着肾上腺皮质的功能。有报道长期应激后肾上腺皮质细胞和细胞核的体积明显增大,脂滴的数量和体积下降。 模型组动物造模2周后力竭游泳时间降低、悬尾实验挣扎时间缩短,水迷宫实验出离时间延长,充分说明躯体、精神疲劳已经产生。这时肾上腺皮质超微结构则显示脂质空泡较少,线粒体管形疏松、轻度肿胀、表明该模型动物处于应激衰竭阶段,即Selye提出的全身性适应综合征的2～3期。服用消疲怡神口服液及人参皂甙组动物行为学指标及单胺类物质的紊乱较模型动物有显著改善,而肾上腺皮质超微结构也显示:脂质较多,线粒体基本正常,表明该动物机体代谢能力良好,线粒体受到保护,其中消疲怡神口服液组的超微结构情况又好于人参皂甙组,这与我们在其他实验中的观察也相一致。说明在慢性束缚方法中,肾上腺皮质超微结构改变、功能受损,进而使动物HPA轴活动受影响,机体应激能力下降可能是产生疲劳的原因之一 实验试剂:俄酸(Osmic Acid,99.6%crystals,JMCL