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登革病毒流行株的分离鉴定 病毒登格病毒（den）是黄病毒属的单体正链氮病毒。根据e蛋白的抗原性，它可以分为den-1、den-2、den-3和den-44。DEN病毒以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介,引起登革热(classical dengue fever, DF)和登革出血热/登革休克综合症(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS)。每年全世界热带与亚热带地区有1亿人感染DEN病毒,其中以与我国接壤的东南亚地区流行最为严重(WHO,1998)。近年来,我国南方频发DF的流行,时有DHF/DSS的病例报告。可见,DEN病毒感染已是一个严重的公共卫生问题。 DHF/DSS表现为高热,出血,休克,病死率较高,但其发生机制不明,多数学者认为DHF/DSS的发生受病毒本身的生物特性和宿主(病人)的免疫因素两方面的影响。近年来,随着人口流动的增加,城市化的发展,DEN病毒型别的地域性分布被破坏,DF的流行区域扩大,DHF/DSS病例亦有增多趋势。有学者认为在一个地区不同血清型或同一血清型中不同基因型的DEN病毒流行可能是DHF/DSS发生的重要原因之一,因此了解流行区DEN病毒毒株的生物学特性及其传播规律,对于阐明DHF/DSS的发病机制,预防DEN感染可能具有重要意义。目前利用DEN病毒的基因序列特征可以鉴定同一血清型中的DEN病毒基因型的差异,并根据这些差异分析流行毒株的来源。Rico-Hesse等发现病毒E/NS1连接区240 bp基因片段相对保守,其随机突变有一定的规律性,能够反映病毒的长期进化趋势,因此利用E/NS1片段分别比较了40株DEN-1病毒和40株DEN-2病毒,分析了同一血清型中不同基因型的病毒之间的进化关系。Goncalvez等利用整个E蛋白基因片段的分析比较,阐述了36株DEN-1病毒的进化关系。这些研究结果表明:根据小片段的基因序列分析所构建的进化树,与整个基因组比较,除在末端分支处有些较小的分歧外,所得结果基本一致。由于小片段基因序列分析简便易行,因而得到广泛的应用。 本研究对2002年广州市传染病医院收集20份可疑DEN病人血清标本进行了病毒的分离与鉴定,在确定为DEN-1病毒后,进一步扩增在病毒进化上有代表意义的DEN-1特异的E/NS1连接区基因片段,测序后构建DEN病毒进化树,与国际参考株和国内分离株的基因序列进行了同源性比较,分析了此次DEN病毒流行株的可能来源,同时测定了该分离株的毒力。 1 材料和方法 1.1 病人血清情况 2002年9月于广州市传染病医院采集可疑DEN病人血清20份 (年龄23～57岁、性别12男,8女)。采血时间为发热后16 h至11 d不等,采血后当天分离血清,冷藏带回,-80 ℃保存。 1.2 细胞培养和rt-pcr 1白纹伊蚊C6/36细胞株用含10%小牛血清(成都哈里),2 mmol/L谷氨酰胺,10 mmol/L Hepes RPMI1640培养液(Hyclone)于无菌24孔板中培养至长成单层细胞。可疑病人血清稀释10倍后接种至C6/36单层细胞,每孔0.3 ml, 28 ℃孵育1 h后去除病人血清,加入含2%小牛血清的RPMI1640培养液继续培养。 出现细胞病变(CPE)后收集培养上清,抽提病毒RNA,进行RT-PCR。如接种后第7天未出现明显CPE,将细胞吹散后盲传,盲传6代后不出现CPE者视为阴性。 1.3 逆转录及pcr试剂 大肠杆菌JM109菌种为本室保存;pMD18-T载体及逆转录试剂盒购自TaKaRa公司;PCR试剂为Promega公司产品。Ⅱ型DEN-2病毒(Tr 1751株)分离自DF病人,由日本感染病研究所大谷.明博士惠赠。 1.4 扩增基因序列及分析 合成DEN病毒的通用引物,上游引物:5′-GTGCACACATGGACAGAACA-3′,下游引物:5′-CTTTCTATCCAATAACCCAT-3′,扩增基因序列位于整个基因组2 492～3 030位,编码NS1蛋白的部分序列,长度为539 bp。 1.5 逆转录及pcr检测 取用血清标本感染的C6/36细胞培养上清,用聚乙二醇(PEG)8000进行浓缩, ISOGEN(Nippon Gene, Toyama,日本)抽提病毒的RNA。病毒RNA逆转录及PCR扩增均按试剂盒说明书操作, 通用引物PCR扩增参数为:95 ℃预变性5 min,94 ℃ 60 s、53 ℃ 60 s、72 ℃ 90 s,30个循环后,72 ℃延伸10 min。PCR产物在1%琼脂糖上电泳分析。 1.6 重组菌的筛选 用Silver beads DNA纯化回收试剂盒(上海Sangon)将RT-PCR扩增产物回收纯化后与pMD18-T载体连接。连