活血化瘀法对早期实验性骨折愈合动物模型骨折断端vegf、bmp-2表达的影响.docx

活血化瘀法对早期实验性骨折愈合动物模型骨折断端vegf、bmp-2表达的影响 骨折早期修复性细胞因子的克隆和活性是骨折愈合的关键。Frost认为许多骨不连或延迟愈合的问题就出现在骨愈合的早期, 骨折后局部瘀血是影响骨折愈合的主要因素。 有基础研究表明, 参与骨折愈合的各种修复性细胞因子的增殖主要在早期约14d以内完成, 相当于中医学对骨折愈合三期分法中的早期。此期治疗以活血化瘀药物为主。因此研究活血化瘀方药对骨折早期修复性细胞因子的增殖和调控作用对探索中药促进骨折愈合的机制有着非常重要的意义。基于上述原因, 我们建立了骨折动物模型。 1 材料和方法 1.1 医用非织造材料,医用器械 大鼠 BMP-2及VEGF试剂盒 (即用型) 武汉博士德生物有限公司提供。BH-2型光学显微镜 (日本OLYMPUS公司) , 切片机 (上海医疗器械四厂) , HC-TP12B-1型天平 (北京医用天平厂) , DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱 (上海一恒科技有限公司生产) , 微量可调加样器:1ml, 50μl, 200μl;外科常用器械 (由陕西中医学院分子生物学实验室提供) 。自购钢锯条 (螺旋测微器测锯齿厚度1mm, 使用前高压蒸汽消毒使之保持无菌) 。 1.2 尾酒各3g 自煎复元活血汤。处方组成:柴胡、天花粉、当归尾各15g, 穿山甲10g, 酒大黄、酒桃仁各30g, 红花6g。用传统煎药方法, 制成含生药量为2g/ml, 备用。 1.3 术后处理和给药 造模方法:以10%水合氯醛按0.3ml/100g腹腔麻醉大鼠, 麻醉显效后左前臂剥毛、消毒, 并切开皮肤肌肉, 用特制咬骨钳将桡骨中段造成1mm的骨缺损, 然后逐层缝合, 不做固定。术后进行3d抗感染治疗, 给予庆大霉素4万单位肌肉注射1次/d。 术后 A组空白组, B组给予生理盐水, C组给予复元活血。用传统煎药方法, 制成含生药量为2g/ml, 按“动物与人体的千克体重剂量折算系数表”折算成等效剂量, 按2ml/100g胃, 从造模后第1天开始, 每日一次, 直至动物处死。 2 常规he染色及bmp-2染色 分别于造模后第3、7、10、14天, 分4次处死大鼠, 以骨折断端为中心上、下0.5cm取材。取材后标本置入浓度为40g/l的多聚甲醛固定24h, 以浓度为100g/l的乙二胺四乙酸钠 (EDTA-2Na) 脱钙1~3周, 石蜡切片厚5μm。分别进行常规HE染色和BMP-2的免疫组化染色。所得免疫组化切片, 用Biomias99图像分析系统软件进行图像处理。 2.1 骨髓厚度测定 细胞浆染色成红色, 细胞核染色成蓝色, 镜下观察骨痂形态。HE切片光镜下测定, 骨组织的厚度在100倍镜下, 每张切片以骨折缺损为中心选取10个视野, 用目镜测微尺测量骨痂厚度并计算平均值。所得数据用SPSS10.0软件进行统计学处理。 2.2 小鼠骨髓内pbs和u-bmp-2-dba的检测 采用卵白素-生物素复合技术 (ABC) , 具体步骤如下:组织固定, 切片常规脱蜡至水;3%H202室温孵育8min以灭活内源性过氧化物酶, 后蒸馏水洗3次, 每次2min;热修复抗原:将切片浸入0.01枸橼酸盐缓冲液 (PH6.0) , 电炉加热至沸腾后断电, 自然降温至室温, 反复1次, 冷却后PBS洗涤2次;滴加5%BSA封闭液。室温孵育20分钟后甩去多余液体, 不洗;BMP-2抗体浓缩液1:50稀释, 组织切片上滴加一抗稀释液, 湿盒37℃2h后PBS液洗3次, 每次2min;添加生物素化山羊抗小鼠IgG, 37℃孵育20min后PBS洗2min×3次;滴加即用型SABC试剂, 37℃孵育20h后PBS洗3次, 每次5min;DAB显色:使用DAB显色试剂盒 (AR1022) , 室温显色, 镜下控制反应时间。苏木素轻度复染。切片依次脱水、透明、封片。结果判定:实验均以PBS代替一抗为阴性对照。正常骨组织VEGF-DBA及BMP-2-DBA染色为阴性, 而骨痂的染色为阳性。染色剂主要在骨小梁以及成骨细胞中着色, 细胞浆呈棕黄色改变, 细胞核呈淡蓝色改变。阳性为棕黄色颗粒, 着色深者为强阳性。着色浅者表达弱阳性。无着色颗粒为阴性。骨切片在400倍条件下每张切片随机选择100个成骨细胞和100个破骨细胞, 计数其阳性百分率。细胞中出现棕黄色染色阳性物质时为阳性细胞。 3 结果与分析 3.1 骨创伤厚度测量 3.2 cagf-dap显示 3.3 bmp-2-daa的显色计数 4 骨瘤厚度和血清vegf及bmp-2阳性细胞数 造模后第3天, 模型组和复元活血汤组在骨痂厚度上无明显差异 (P0.05) ;造模后第7、10、14天模型组和复元活血汤组在骨痂厚度上有极显著性差异 (P0.01) 。造模后第3天