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大鼠没食子酸丙酯的体内代谢研究 非脂肪丙酯是中药赤芍的有效组成部分之一。笔者前期对赤芍的体内代谢进行了较为系统的研究, 从灌胃赤芍后的大鼠尿液和血浆中共鉴定出15个吸收成分和90个代谢产物, 推测其中31个代谢产物可能来自于赤芍中的没食子酸类成分。没食子酸丙酯最早由我国学者对赤芍有效成分没食子酸进行结构修饰而得到, 较没食子酸具有更强的生物效应。其具有抗氧化作用, 抗血小板聚集作用, 对大鼠缺血再灌注时心肌线粒体功能具有保护作用, 同时有报道称没食子酸丙酯可改善荷瘤鼠血液凝固状态和血小板功能而实现其抗肿瘤作用。Nakagawa Y等认为肝细胞可将没食子酸丙酯代谢为没食子酸、4-O-甲基-没食子酸、没食子酸二聚体。叶蕻芝等认为在人工胃、肠液中没食子酸丙酯稳定, 在小鼠肝微粒体液中代谢明显。进行没食子酸丙酯的体内代谢研究有助于阐明其代谢产物和代谢途径, 进而揭示它在体内的存在形式, 这对于确定没食子酸丙酯的体内显效形式及药理作用机制, 对于预测潜在的药物相互作用具有重要意义。 1 仪器、试剂与动物 岛津Shimadzu LC-MS-IT-TOF液质联用仪:由2个LC-20AD输液泵、1个LC-20AB输液泵、CBM-20A系统控制器、脱气单元DGU-20A3、可制冷自动进样器SIL-20AC、柱温箱CTO-20A、二极管阵列检测器SPD-M20A、ESI离子源、离子阱-飞行时间质谱系统等模块构成。数据的采集和处理采用Shimadzu公司的LCMSSolution Version 3.60.361软件、分子式和元素组成预测采用Formula Predictor和Accurate Mass Calculator软件。 乙腈 (HPLC级, 美国Fisher公司) ;甲酸 (HPLC级, Mreda Technology) , 甲醇 (色谱纯, 天津大茂化工厂) , 去离子水 (18.2 MΩ, 经Milli-Q纯水净化系统纯化) , CMC-Na (分析纯, 科贸化学试剂有限公司) 。取血管 (3.8%枸橼酸钠1∶4, 河北鑫乐科技有限公司) 。 没食子酸丙酯 (批号 和没食子酸甲酯 (批号 均购自国药集团化学试剂有限公司;没食子酸 (批 购自上海展舒化学科技有限公司;3-O-甲基-没食子酸 (批023) 与没食子酸乙酯 (批号WZGYC-0G) 均购自百灵威科技有限公司。 SD大鼠, 雄性, 体重250~300 g, 购于北京大学医学部动物科学部。所有动物实验均得到北京大学医学部伦理委员会的许可, 许可证号LA2011-058。 2 方法 2.1 超声提取 将没食子酸丙酯混悬于0.5%CMC-Na溶液中, 使用前再次涡旋混匀。 第1次和第2次给药后收集24 h内的尿液, 每天收集之后置-30℃冰箱保存, 最终将收集到的尿液用旋转蒸发仪在50℃浓缩至干, 取其中1.00 g加4 m L甲醇超声提取30 min, 5 000 r·min-1离心15 min, 取上清液, 过0.45μm滤膜, 待液质分析。 在第3次给药后, 分别在给药后0.5, 1, 1.5 h取2只大鼠, 腹腔注射水合氯醛麻醉, 心脏穿刺取血, 将所取全血于3 000 r·min-1离心15 min, 取上清液, 从中取5 m L, 加20 m L (4倍量) 甲醇超声20min, 5 000 r·min-1离心15 min去除蛋白, 取上清液, 用旋转蒸发仪在40℃浓缩至干, 加5 m L甲醇过0.45μm滤膜, 用氮气吹干, 加200μL甲醇超声30min, 5 000 r·min-1离心15 min, 取上清液以备液质分析。 2.3 质谱条件和检测条件 HPLC检测条件:Phenomenex Gemini C18色谱柱 (4.60 mm×250 mm, 5μm) ;柱温35℃;进样体积5μL;流动相A-0.1%甲酸, B-乙腈;流速1.00 m L·min-1, 分流为0.20 m L·min-1后进入质谱;洗脱梯度0~12 min, 0%B;12~33min, 0~8%B;33~37.5 min, 8%B;37.5~52.5min, 8%~12%B;52.5~82.5 min, 12%~25%;82.5~105 min, 25%~60%B;105~120 min, 60%~100%B。 质谱检测条件为ESI离子源;MS1~MS3检测范围 (m/z) 为50~1 000;离子累积时间, 20~30 ms;雾化气 (氮气) 流速, 1.5 L·min-1;曲型脱溶剂管和加热块温度, 200℃;CID能量50%;检测器电压, 1.70 k V;干燥气 (氮气) 压力, 98.0 k P