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甜瓜抗肺病基因分子标记的研究 通过分子标记和分子家谱的应用，促进了对科学家和植物抗病基因的新发现。在已克隆的植物抗病基因中,不少是借助紧密连锁的分子标记通过图谱克隆技术实现的。利用分子标记和近等基因系有助于鉴别含抗病基因的染色体片段。然而,近等基因系的构建需要多年的连续回交,许多作物要定位的抗病基因并无现成的近等基因系可供利用。为此,Michelmore等提出了“分群法”用来鉴定与目标基因连锁的分子标记。其基本要点是将某等位基因的分离群体按基因的表型分成两个小群,将每群内植株的DNA等量混合,形成按表型区分的DNA池,即“近等基因池”,检测近等基因池的多态性可望发现与目的基因连锁的分子标记。在甜瓜上,Patrick Wechter等和Zheng等利用“分群法”鉴定了与枯萎病抗性基因Fom-2紧密连锁的分子标记。 白粉病是危害甜瓜露地和保护地栽培的重要病害之一,主要由2种不同病原菌——瓜单囊壳(Sphaerot ecafuliginea)和二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)引起,我国以瓜单囊壳为害较为普遍。广泛搜集甜瓜种质资源,筛选抗源,培育和推广抗病品种是防御白粉病的一条最安全、经济、有效的途径。笔者在以往甜瓜种质资源评价与创新工作中鉴定了一批甜瓜白粉病抗源,本文报道甜瓜白粉病抗源1A151的抗性遗传与抗性基因的分子标记,以推动甜瓜白粉病分子标记辅助育种的发展。 1 材料和方法 1.1 材料表面 抗源1A151由国家蔬菜工程技术研究中心种质库提供;感病品种恒进红瓤酥购于北京种业市场。 1.2 方法 1.2.1 抗性遗传分析 甜瓜白粉病抗源1A151(网纹甜瓜)与高感品种恒进红瓤酥(薄皮甜瓜)配置了杂交组合,根据其6个世代(P1,P2,F1,F2,BCs和BCr)群体的抗感反应进行抗性遗传分析。 1.2.2 温度、湿度控制 2001年10月在国家蔬菜工程技术研究中心空调温室准备6世代种子双亲及F1各10粒、F2群体100粒左右、BCs和BCr各60粒左右,发芽后播种于营养钵,营养钵随机排列置于托盘中,托盘放在钢丝床上。昼/夜温度30℃/20℃,以培育壮苗。待第2片真叶完全展开时营造发病的环境条件:①风媒接种——从另一温室将充分发病的感病对照品种移到抗性鉴定温室中,并与供试材料放在一起(以提供病原菌分生孢子),依靠空调产生的气流,将病株叶面白粉病菌分生孢子接种到供试材料上(病原取于北京地区日光大棚)。②控制温度——白天为28℃,夜晚为20℃。③控制湿度——白天在温室水泥地面上浇水多次,保持相对较高的空气湿度。当感病对照品种充分发病,开始观察供试材料对甜瓜白粉病菌的抗感反应。14 d后当感病亲本充分发病时,按Epinat等确定的0～9级病情分级指数标准(抗病:0,1;中抗:3,5;感病:7,9)调查供试材料对白粉病菌的抗感反应参数。 1.2.3 dna的提取 亲本各株取等量叶片混合,F2群体以单株为单位逐个进行。将适量未接种的幼叶在研钵中用液氮研碎,按CTAB方法提取基因组DNA。从F2群体选高抗株(无病斑)和高感株(高度感病)各10株,将10个高抗株(或高感株)的DNA等量混合,形成抗病(或感病)的DNA池,即抗感近等基因池。 1.2.4 pcr扩增taq酶 RAPD扩增引物购于上海生物工程技术有限公司。PCR扩增仪为PE9600。扩增反应体积20μL,含20 ng模板DNA、200 mmol dNTP、1×PCR Buffer、2.5 mmol MgCl2、0.2 mmol引物,1U Taq酶(购于中国科学院遗传研究所)。扩增条件:94℃,预变性2 min;94℃变性18 s、36℃退火30 s、72℃延伸1 min,(循环45次);72℃延伸7 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶与1×TAE缓冲液中电泳分离。电泳结果在紫外透射仪观察后,经电脑成像扫描仪记载结果。 1.2.5 分离群体中抗性基因的遗传距离 利用χ2测验分析分离群体与回交群体的抗感分离比例,以及分离群体分子标记的分离比例。 利用极大似然法(Allard,1956)在分离群体分析抗病基因与分子标记间的连锁关系,即根据携带阳性标记的配子与携带隐性抗性基因的配子间的重组率来确定抗性基因与分子标记间的遗传距离:c=1-(N1+N2/2)/N,其中c为重组率,N为分离群体中感病植株数,N1为分离群体中标记基因型纯合的感病植株数,N2为分离群体中标记基因型杂合的感病植株数。Vc=c(l-c)2N,其中Vc为估计重组率的方差。 2 结果与分析 2.1 fpsdvf基因回交回血特征结果 分析了抗源1A151与感病品种恒进红瓤酥配置的抗感交组合的6个世代(双亲、F1,F2,BCs和BCr)对白粉病菌系的抗性遗传见表1。Fl抗性水平明显高于感病亲本,但接近