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甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力试验检测法的建立 由于绝活动苗动物体内的活性检测周期通常很长，结果受到多种因素的影响。因此，国际药物环境咨询协会（internationalconditionsofinformationsecurity）建议使用动物方法来验证产品的质量。2005年版《中国药典》第三卷也提出：“尽可能使用正确、可靠的化学方法、物理或细胞学方法，代替动物测试来进行植物园质量测定，以减少动物样品的试验。”国家标准化委员会发布的《生物化学技术指南》规定，在研究过程中，有必要建立外部效应检测方法。我所甲型肝炎灭活疫苗(inactivated hepatitis A vaccine,IHAV)工艺成熟完善、产品质量稳定可控,为此,参照相关规定及原则,建立双平行线体外相对效力试验检测方法,用于甲型肝炎灭活疫苗的效力价。 检测条件及方法 1.材料:甲型肝炎病毒抗原(HAAg)检测采用双抗体夹心ELISA法检测试剂,本所自制;甲型肝炎病毒抗体检测采用竞争法ELISA检测试剂,本所自制;灭活疫苗病毒解离剂:参照2005年版《中国药典》三部附录配制;试验参比品按国家药品标准(国药标字S-016号)进行制备及全面检定,合格后经标定使用。 2.方法:(1)病毒解裂:精密量取待检样品0.1ml,加入0.1ml病毒解离剂,混匀,于20~28℃放置30min。(2)甲型肝炎病毒抗原(HAAg)检测:将处理后的参考品和供试品用供试品稀释液进行2倍比系列稀释,取适宜稀释度用甲肝病毒抗原检测试剂进行检测,每个稀释度做2个复孔,100微升/孔,湿盒中37℃湿盒中保温2h,用洗板机洗板4~5次;加酶结物100微升/孔,37℃湿盒中保温1h,用洗板机洗板4~5次;加显色液100微升/孔,37℃保温避光放置10min;加入终止液50微升/孔;酶标仪检测各孔A值。(3)样品含量与反应值的线性关系分析:用我所甲肝病毒抗原ELISA检测试剂对待检样品进行检测,对样品稀释度的对数值与相对应OD值及OD值的对数分别进行直线回归分析,计算各自的R2值。(4)小鼠体内相对效力检测:将待检疫苗每批多支混合后作2倍系列稀释,取3个合适的稀释度接种小鼠,每个稀释度接种小鼠10只,每只腹腔注射1.0ml;试验同时设效力试验参比品作为对照。4周后采血,分离血清,用甲型肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒测定小鼠血清的抗-HAV抗体,用Reed-Muarch法进行统计分析,分别计算待检品及参比品的ED50,再计算待检品ED50与参比品的ED50的比值。(5)体外相对效力检测方法的建立:按照量反应双平行线测定法原理,建立(4,4)法体外相对效力检测方法。首先按病毒解裂方法对待检样品及效力参比品分别进行甲肝病毒抗原检测,然后以各稀释度实测OD值为反应值(参比品为S1~S4,待检品为T1~T4),按量反应平行线测定法计算待检样品与参比品的相对效力(R值)。R=D×antiLgIVWΙVW,其中:D=dS4dT4?I=lg2=0.301,V=1/4(T1+T2+T3+T4?S1?S2?S3?S4),W=1/20[(T3?T2+S3?S2)+3(T4?T1+S4?S1)]D=dS4dΤ4?Ι=lg2=0.301,V=1/4(Τ1+Τ2+Τ3+Τ4-S1-S2-S3-S4),W=1/20[(Τ3-Τ2+S3-S2)+3(Τ4-Τ1+S4-S1)]。(6)双平行线检测方法的可靠性验证: 根据2005年版《中国药典》二部附录ⅩⅣ“生物检定统计法”规定及2005年版《中国药典》二部附录ⅩⅨ A“药品质量标准分析方法验证指导原则”,对所建立的量反应平行线测定法进行可靠性验证,验证指标为:回归、偏离平行、二次曲线、反二次曲线4项。要求回归应非常显著(P0.01),偏离平行、二次曲线、反二次曲线三项均应不显著(P0.05)。双平行线(4,4)2个复孔检测法f= 8,F(1,8)0.01=11.26,F(1,8)0.05=5.32,即当F11.26时,P0.01,非常显著;F5.32时,P0.05,不显著;满足以上条件时验证通过。 结果 1. b分析检测od值与od值的相关性,符合以下情况 用我所甲肝病毒抗原ELISA检测试剂对待检样品进行检测,对样品稀释度(1∶8~1∶1024)的对数值与相对应OD值及OD值的对数分别进行直线回归分析,所有样品均表现出良好的线性回归,特别是样品含量与OD值的对数之间具有高度的相关性,R2均在0.97以上,平均值为0.990,按生物检定的基本原则,适用于建立双平行线检定方法。 2. 实验结果的分析 对量反应平行线测定法进行可靠性验证,验证指标为:回归、偏离平行、二次曲线、反二次曲线。用所建立的效力试验参比品分别对3批灭活疫苗进行检测,通过对3批样品3人次检测共9个结果的分析,验证