绿绿僵菌mearhimiumflavoviride菌株对褐飞虱的侵染研究.docxVIP

绿绿僵菌mearhimiumflavoviride菌株对褐飞虱的侵染研究 20世纪50年代以来，褐飞虱（stue560l）（bth）逐渐发展为亚洲水稻病虫害的主要类型之一。由于其高度流动性和抗药性，水稻发生严重爆炸，甚至灭绝。（程家安、朱增荣，2006）。目前，化学防治是褐飞虱的主要防治方法，但由于这种方法对人类健康和环境造成的危害，迫使人们寻求与环境相和谐的生物农药替代化学农药。白僵菌、绿僵菌等虫生真菌是以独特的方式侵入，其分生孢子主要通过表皮萌发侵入昆虫体壁，也可通过消化道、伤口等途径侵入虫体(季香云和杨长举，2003;Liu et al．,2010)，这为褐飞虱的生物防治提供了可能。黄绿绿僵菌属于丝孢纲绿僵菌属，能寄生直翅目、同翅目等多个目的昆虫，英国致力于将该菌发展为杀虫剂在西非治蝗(蒲蛰龙和李增智，1996)。目前，Geng和Zhang(2004)从广东省稻田自然感病褐飞虱虫尸上分离、鉴定得到黄绿绿僵菌菌株，并利用该菌株对褐飞虱进行生物测定，结果表明对成虫和若虫都有较高的致病力，同时用黄绿绿僵菌孢子外包植物油层制成可控制褐飞虱种群数量效果较好的真菌乳悬剂。但对黄绿绿僵菌对褐飞虱致病机理及入侵机理方面的相关研究报道还未见到。现代扫描电镜技术能够对材料表面微区进行定性定量分析，使我们能够观察材料表面的细微形貌及内部组织特征，得到许多充满信息的清晰图像。 本实验从褐飞虱罹病虫体分离到1株对褐飞虱毒力较高的黄绿绿僵菌Mf82菌株，经生物测定表明对褐飞虱的致病死亡率可达80%以上(已另文发表)。通过对侵染过程的定期取样，利用扫描电镜观察了该菌株的分生孢子在褐飞虱虫体的附着部位，孢子萌发，侵入时间和侵入行为，为揭示黄绿绿僵菌侵染褐飞虱的途径、过程及机理研究提供直观的依据。 1 材料和方法 1.1 分离菌株培养 供试菌株是从褐飞虱罹病虫体分离到1株对褐飞虱较高毒力的黄绿绿僵菌Mf82菌株，保存于安徽农业大学昆虫病理实验室。在SDAY斜面上接种分离菌株并培养10 d左右，置于4℃冰箱中保存，供试验所用。 供试褐飞虱Nilaparvata lugens(Stue560l)采自霍邱县田间，在安徽农业大学植保学院智能人工气候培养室内繁殖10代以上，选取发育状况一致的褐飞虱成虫作为接菌对象。 1.2 分生孢子悬浮液母液的制备 将保存在冰箱中的供试菌株转接到SDAY平板培养基上，(25±1)℃、无光条件下培养10 d，待真菌充分产孢后，用灭菌的接种环轻轻将该菌株的分生孢子粉刮到分别盛5 mL 0.05%Tween-80湿润剂的三角瓶中，在涡旋混合器上充分振荡30min，待链状分生孢子断裂和分散后，用双层无菌纱布过滤菌液，获得孢子悬浮液母液。用血球计数器计数每毫升母液的分生孢子含量，然后按比例稀释，配制成1.0×108个孢子/mL浓度的供试孢子悬浮液。 1.3 喷药、进行观察 用灭菌的吸虫器从人工气候室饲养的褐飞虱中采集大小一致的褐飞虱成虫40只，迅速放入4个有稻苗的200 mL烧杯中，每个烧杯10只褐飞虱成虫，用手动喷雾器将菌液均匀喷于其中3个烧杯里的供试虫体，另一个烧杯作为空白对照，只用0.05%Tween 80的水溶液处理。喷施时在其中放置三块盖玻片(1 5 mm×15 mm)收集孢子，镜检5个视野(0.785 mm2/视野，5点取样)并计数孢子数，以确定褐飞虱实际接收的剂量(孢子/mm2)。用医用纱布将烧杯口封住，既透气又可防止褐飞虱逃逸。将处理的褐飞虱置于25℃、相对湿度85%的恒温培养箱中饲养，死亡的褐飞虱放入带有无菌滤纸的培养皿(d=9 cm)中保湿培养。 1.4 褐飞锑解剖镜观察 真菌侵染卵巢中卵块:用吸虫器采集即将产卵的褐飞虱10只，按照1.3接菌方法接菌并培养4 d，待菌丝在褐飞虱体表大量生长，用无菌昆虫解剖刀在无菌操作台解剖感染黄绿绿僵菌的褐飞虱腹部，得到卵块后在型号为Nikon-DSS230解剖镜下观察是否有菌丝。若有，再把样品置于无菌培养皿，在25℃和RH 85%条件下培养48 h。 真菌侵染褐飞虱体内组织:样品处理方法同上。 1.5 样品处理和喷金 按感染黄绿绿僵菌的褐飞虱虫体表面、褐飞虱腹部(纵切)和体内卵块3种部位分别取样，样品先用3%戊二醛隔夜固定12 h后，再用锇酸固定12 h，然后用磷酸缓冲液浸洗3次，30 min/次;用50%，70%，80%，90%，100%乙醇，逐级梯度脱水，每级12 h(Becnel,1997)，其中100%乙醇脱水2次。用醋酸异戊酯置换2次，每次停留30 min。样品置于室温下自然干燥后，用导电胶将样品粘于扫描电镜样品台上，然后经离子溅射法喷金(李庚午，1994)。在TM-1000 HICHMI型扫描电子显微镜下进行观察并拍照。 2 结果与分析 2.1 绿噬菌分生孢子侵犯褐飞锑体