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杜仲叶与胶原合成的相关性研究 杜仲原产于中国，是一种伟大的落叶树。其树皮入药,《神农本草经》及《本草纲目》记载其功效为:补中,益精气,坚筋骨,轻身,耐老等。在现代药理学中,这些功效均与蛋白代谢,尤其是胶原合成密切相关。随着年龄增加,蛋白尤其是胶原合成速度减慢,角质层更新也随之减慢。据推测杜仲可能是通过激活蛋白代谢而阻止衰老进程。研究表明,杜仲叶(EUOL)与杜仲树皮所含化合物极为相似,故推测二者药理作用也相近。实验己证实杜仲叶热水提取物能刺激假老龄模型大鼠的胶原合成,进一步的研究需探讨提取物中主要起作用的物质以及抗衰老的其它机制。 1 水溶液甲醇提取物 使用雄性Wistar/ST大鼠,自由摄取低蛋白含量食物(6%或11%),成为假老龄模型大鼠(AMR)。 EUOL甲醇提取物的制备:新鲜杜仲叶经干燥、粉碎、过300目筛,加入10倍量的甲醇,超声振动1h,过滤,滤渣以相同方式再提取,收集滤液,40℃真空浓缩,冻干。甲醇提取物再加10倍量的蒸馏水,超声处理,过滤,滤渣重复提取,滤液浓缩,冻干即得水溶性甲醇提取物(WSME)。均于-80℃保存。 所用的其它药物或试剂有:京尼平甙酸(GA),桃叶珊瑚甙,丹磺酰氯等。 2 甲醇提取物对产生母乳肿和沉积物合成的影响 2.1 肉芽肿重量及胶原合成情况比较 雄性大鼠Wistar/ST (7周龄,平均体重209g) 15只均分为3组:对照组仅饲以含6%蛋白食物;两观察组均同时给予EUOL甲醇提取物,剂量分别为1.8、2.7g干杜仲叶/kg体重·d,剂量采用相应的干杜仲叶重量来表示以便于比较,以下均略为g/kg·d。用4周,实际剂量按前一天的摄入量计算。用药3周后,在大鼠背部植入4片福尔马林浸泡过的滤纸片(FFP法),植入后1周心脏穿刺放血处死大鼠,取出长有肉芽肿的滤纸片及其它器官,称重并分析肉芽肿中羟脯氨酸的含量,羟脯氨酸经水解等反应转化为胶原含量。结果,两观察组肉芽肿重量及胶原合成均明显高于对照组(P0.05),1.8g组分别增加69%、68%;2.7g组分别增加131%、131%。 2.2 n-己烷及乙酸乙酯的组分d 上述实验动物45只,均分为9组:对照组饲以6%蛋白食物;其余各组分别同时给予EUOL甲醇提取物经层析分离所得的组分,即n-己烷组分1.5及3.1g/kg·d;乙酸乙酯组分1.5及2.9g/kg·d;丙酮组分1.5及3.0g/kg·d;甲醇组分1.5及3.0g/kg·d。以下实验步骤同上。结果,n-己烷、乙酸乙酯及甲醇组分对肉芽肿重量及胶原合成的影响与对照组相比均无变化,丙酮组分3.0g/kg·d则明显促进肉芽肿形成(56%)及胶原合成(57%),P均0.05。 2.3 不同剂量带ga 上述实验动物20只,均分为4组:对照组仅饲以6%蛋白食物;3个观察组均同时给予GA,剂量分别为25、50、100mg/kg·d。干杜仲叶中GA的含量约为2%。以下实验步骤同上。结果,GA明显增加肉芽肿形成及胶原合成(P0.05),三个剂量组分别增加82%、79%;53%、82%;69%、95%。 2.4 桃叶药物作用 上述实验动物(6周龄,平均体重191g) 15只,均分为3组:对照组饲以6%蛋白食物;两观察组均同时给予桃叶珊瑚甙,剂量分别为25、50mg/kg·d。干杜仲叶中桃叶珊瑚甙的含量约为2%。以下实验步骤同上。结果,桃叶珊瑚甙明显增加肉芽肿形成及胶原合成(P0.05),25mg组肉芽肿形成增加60%;50mg组则分别增加92%、99%。 此外,GA及桃叶珊瑚甙对AMR体重、肝脏、肾脏、脾脏或胸腺重量均无影响。 2.5 甲醇提取物的作用 实验结果表明,EUOL甲醇提取物对肉芽肿形成与胶原合成的促进作用呈剂量依赖性。甲醇提取物经硅胶柱层析分离得到不同组分,其中丙酮组分主要含环烯醚萜单甙类,如GA和桃叶珊瑚甙,说明EUOL甲醇提取物促进肉芽肿形成和胶原合成的实际作用物质为GA和桃叶珊瑚甙,后者作用稍弱于前者,且二者均未观察到副作用。 3 ga的影响是amr层的更新率 3.1 amr荧光变化 剪除AMR (9周龄)背毛,酒精清洁皮肤,乙醚麻醉,取肩胛骨下方1.5cm处皮肤,于2%丹磺酰氯乙醇溶液(5μl)中均匀染色。染料与皮肤发生反应,荧光开始出现。24h后荧光达最大值,于暗背景下用UVTN-F5荧光计测定首次丹磺酰氯荧光值,并连续测数日。同时测定无染色暗背景该处的荧光值,每处测3次,所测荧光值减去平均暗背景值即实验所需荧光数据。AMR角质层更新率以50%丹磺酰氯荧光廓清天数(DCFCD)来表示,50%DCFCD计算如下:将第1d的荧光值计为100%,以后的每个丹磺酰氯荧光值则转换为相对百分值。对天数与相对荧光百分值进行线性回归分析,据线性函数得出50%DCFCD。 3.2 wsme对大鼠角质层