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种子中蛋白质的多态性及其电泳鉴定 种子中的蛋白质成分是基因形成的产物，记录了种子在发育过程中的亲和力，以及种子和品种之间的遗传差异。种子蛋白质的多态性是鉴别品种间遗传差异的重要标志, 其差异不易受环境条件的影响, 这在品种真实性和纯度检验上有着非常重要的意义。 1 种子含有 1.1 清蛋白质 能溶于水, 包括大多数酶蛋白。可用同工酶电泳方法鉴定。 1.2 蛋白体蛋白贮藏 能溶于稀盐溶液, 主要存在于膜结合的蛋白体中, 是一种贮藏蛋白。贮藏蛋白不具有酶活性, 贮藏于蛋白质体内, 成熟期大量积累, 是种子发芽时的主要氮源。 1.3 小麦种子醇溶电泳 能溶于醇类水溶液, 也是一种贮藏蛋白。国际上和ISTA广泛应用的小麦和大麦种子醇溶电泳, 就是利用这种蛋白质进行品种真实性和纯度的检验。 1.4 不同种植物种间种子蛋白质不同类型的差异 能溶于稀碱和稀酸溶液中, 为结构蛋白。核酸电泳就是对这种蛋白进行品种和遗传鉴定。 通过检测玉米、棉花、甜瓜的种子蛋白质发现, 不同植物种之间种子蛋白质类型的比例是有差异的。但这种比例上的差异并不能全面地反映品种的真实性和纯度, 应通过电泳方法找出这几种蛋白质多态性的差异, 为选择品种真实性和纯度的电泳鉴定方法中的目标蛋白质提供依据。表1 2 溶解分离法 种子蛋白质的提取可分步提取或一次性提取, 分步提取法研究种子中各类蛋白质的组成及比例, 该方法根据种子蛋白质不同的溶解性达到分离的目的。虽然方法本身不太严格, 特别是谷蛋白的分离难以完全, 但其它的分析技术, 难以把所有蛋白质明确地划分为某几类, 因此溶解分离法以其较强的实用性沿用至今。一次性提取法主要比较在不同提取液情况下, 蛋白质谱带的带型。 2.1 离心沉淀液的制备 清蛋白 取样品1～2 g加水10 ml, 研磨3次合并离心, 取上清液加水定容至50 ml。 球蛋白 取清蛋白的离心沉淀物, 加入10 ml 10%氯化钠溶液, 搅拌15 min, 重复3次, 合并离心取上清液加10%氯化钠溶液定容至50 ml。 醇溶蛋白 取球蛋白的离心沉淀物, 加入10ml 75%乙醇, 搅拌15 min, 重复3次, 合并离心取上清液加75%乙醇定容至50ml。 谷蛋白 取醇溶蛋白的离心沉淀物, 加入10 ml 0.2%氢氧化钠溶液, 搅拌15 min, 重复3次, 合并离心取上清液加0.2%氢氧化钠溶液定容至50 ml。 将上述分离出的4种蛋白质组分放入消化瓶中, 按凯氏定氮法分别测定其含量。 2.2 电泳样品的制备 清蛋白提取液 取蔗糖20 g、溴酚兰0.025 g, 用双蒸水定容至50 ml。 球蛋白提取液 取氯化钠0.58 g、蔗糖20 g、甲基绿0.015 g, 用双蒸水定容至100 ml。 醇溶蛋白提取液 取2-氯乙醇20 ml、甲基绿0.05 g、尿素18 g、巯基乙醇1 ml, 用双蒸水定容至100 ml。 谷蛋白提取液 取2-巯基乙醇7.5 ml、甲基绿0.05 g、甘油10 ml, 用双蒸水定容至100 ml。 制备电泳样品时, 取单粒种子, 粉碎后加入等体积的种子蛋白提取液, 放置过夜后, 离心取上清液15-20μl, 电泳、染色后即可比较不同种子蛋白之间多态性的差异。一般地讲, 电泳的谱带越多, 其多态性越好。 在鉴定品种的真实性和纯度时, 需首先研究种子的遗传特性, 应用电泳的方法分析不同种子蛋白质多态性的差异, 确定目标蛋白质。这是品种资源研究和种子质量分析的一种有效方法。