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利用嗜热四膜虫对阿散酸及其降解物的砷吸收模型研究 环境降解与生物释放 氨基苯磺酸作为一种有机的饲料添加剂在国际上被广泛使用。促进山羊的生长，限制球虫和腺体的杆和杆，对大肠杆菌有有效改善山羊的产量和蛋率。 但约有90% Arsanilic acid以初始形态通过畜禽粪便、 尿液等形式排泄进入到周边水、 土壤等自然环境, 降解为具有明确毒性效应的无机砷化合物, 从而参与食物链等生物传递过程, 直接威胁人类健康。 单细胞原生动物嗜热四膜虫在食物链中居于能量流和物质流的重要环节, 不仅具有绝大多数真核细胞中典型的亚细胞结构, 而且具备完整生命体所有的细胞器, 能够反映细胞层次和生命独立个体层次的变化。 本文以嗜热四膜虫对阿散酸 (Arsanilic acid) 及其环境降解物As (Ⅲ) 和As (Ⅴ) 的砷吸收为模型, 研究有机胂饲料添加剂Arsanilic acid在环境释放与降解过程中对生物体的影响。 结果表明, 阿散酸及其环境降解产物As (Ⅲ) 和As (Ⅴ) 作用于四膜虫后, 砷的吸收首先发生在细胞膜上, 然后进一步渗透扩散进入细胞内, 生物体通过细胞的砷吸收而引起毒害。 1 实验部分 1.1 氢化物的发生-原子荧光光谱 恒温培养箱 (上海跃进医疗器械厂) , 手提式灭菌器 (上海申安医疗器械厂) , 恒温水浴锅 (上海天平仪器厂) , SP-3900型流动注射氢化物发生-原子荧光光谱仪 (上海光谱仪器有限公司) 。 HG-AFS主要工作参数见表1。 1.2 试剂和方法 1.2.1 cl-1和as2o3 Arsanilic acid标准溶液 (1 000 μg·mL-1) (以As计) : 称取0.289 8 g Arsanilic acid标准样品 (分子量217.04, 纯度98%, Sigma Aldrich) 溶于含有0.5 g NaOH的水溶液中, 转移至100 mL容量瓶中, 定容。 As (Ⅲ) 标准溶液 (1 000 μg·mL-1) : 称取0.132 0 g As2O3溶于少量1mol·L-1氢氧化钠溶液, 用盐酸溶液调节至近中性, 后转移至100 mL容量瓶中, 定容。 As (Ⅴ) 标准溶液 (1 000 μg·mL-1) : 称取0.153 4 g As2O5溶于去离子水, 后转移至100 mL容量瓶中, 定容。 分别取上述配制标准样品溶液过滤除菌, 再逐级稀释得到总砷浓度为0.1, 0.5, 2.5, 5.0, 10.0 μg·mL-1的Arsanilic acid, As (Ⅲ) 和As (Ⅴ) 系列标准溶液。 1.2.2 模拟arsonilicacid环境降解溶液的配制 文献报道, 在光照条件下Arsanilic acid可降解形成不同比例的Arsanilic acid与As (Ⅲ) 和As (Ⅴ) 共存的环境降解混合物。 Arsanilic acid, As (Ⅲ) 和As (Ⅴ) 标准溶液按不同比例配制总砷浓度为20 μg·mL-1的模拟Arsanilic acid环境降解混合溶液, 相应Arsanilic acid: As (Ⅲ) : As (Ⅴ) (摩尔比) 分别为: A=2.5∶1.5∶6; B=1.5∶1.5∶7; C=0.8∶0.8∶8.4。 然后分别逐级稀释为总砷浓度分别为0.1, 0.5, 2.5 μg·mL-1的系列溶液用于四膜虫样品砷吸收实验。 2 爱热四膜昆虫砷吸收模型 2.1 模拟环境降解混合溶液的制备 在20 mL培养基中接入四膜虫虫种, 使得培养基虫种密度为1.5×104个·mL-1, 同时向培养基中分别加入上述Arsanilic acid系列标准溶液及不同比例模拟Arsanilic acid环境降解混合溶液, 每个试验样品设置3个平行样, 于28 ℃下恒温培养72 h。 2.2 四膜昆虫膜及膜内清液硫的测定 2.2.1 膜虫膜内清液的制备 四膜虫细胞膜及膜内清液的分离: 4 000 r·min-1转速下离心四膜虫悬液收集细胞。 用pH 7.41的磷酸盐缓冲溶液和去离子水反复多次离心洗涤细胞, 除去四膜虫体外的含砷培养基。 细胞浆液中加去离子水至1 mL, 于-20 ℃下反复冻融使细胞裂解, 离心分离得到细胞膜及膜内清液。 四膜虫细胞膜及膜内清液的消解: 细胞膜及膜内清液含有大量脂类物质如氨基酸、 蛋白质、 核酸等, 在氢化物发生反应时产生大量泡沫, 影响砷化氢气体的传输, 使砷的荧光信号很不稳定, 因此需要进行消解, 破坏共存的有机物质。 本工作分别向细胞膜及膜内清液加入500和150 μL新鲜制备的王水, 后置于恒温水浴锅50 ℃下密闭处理24 h。 四膜虫生物样品预还原: 加入预还原剂 (100 g·L-1硫脲, 50 g·L-1抗坏血酸) 使砷还原为三