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芸属黄酮3羟化酶基因家族rnai载体的构建

云南星科和卡其色科属于十字花科。有许多重要的粮食。例如，如b.natha和b.russella（a）是重要的油植物，而甘兰（b.rapa，a）和b.russella（abb）是蔬菜和油植物。甘兰属植物是一种由天然远缘杂交和重现的四倍体种子。

类黄酮(flavonoids)物质是广泛存在于植物界的重要次生物质,对植物的生长发育、抗病性、抗逆性、品质形成及根瘤共生等有重要的生理意义。芸薹属花瓣和花粉中的色素主要为黄酮醇类,与吸引昆虫异花授粉、繁殖种子紧密相关,也是金黄色菜花的观赏价值之所在。黄酮醇、黄酮等还是白菜、甘蓝等芸薹属蔬菜茎叶中的重要保健性成分,具有清除自由基和增加人体抗氧化活性的作用。紫菜苔、羽衣甘蓝等植株体内的紫红色色素是花青素苷,它既是很好的天然色素,在人体内也具有抗氧化的保健价值,还是羽衣甘蓝等的观赏价值之所在。原花青素(单宁)是油菜等植物种皮中黑褐色色素的主要成分,降低种皮色素可以减少油菜籽初榨油的色素污染,提高菜籽饼粕的饲用经济价值。在相同遗传背景下,黄籽油菜比黑籽油菜具有种皮薄,出油量高,油和饼粕中色素、木质素含量低等优点,黄籽是油菜遗传改良重要性状。甘蓝型油菜中不存在天然的黄籽基因型,但通过远缘杂交培育的黄籽甘蓝型油菜存在黄籽表型欠稳定、一致性差的问题。

类黄酮物质的生物合成均需要类黄酮3′-羟化酶(F3′H)的参与,它在类黄酮途径中催化早期反应步骤,仅位于查尔酮合酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)之后,与黄烷酮3-羟化酶(F3H)具有平行关系。F3′H是细胞色素P450家族的一个重要成员,能在辅因子NADPH和O2的作用下,羟化柚皮苷和二氢山柰酚B-环上3′位置,形成圣草酚和二氢槲皮素,进而合成黄酮醇、花青素苷、原花青素等。

RNA干扰(RNAi)是一种转录后水平的基因沉默技术,相对于反义及共抑制技术,可获得更高的基因沉默效率。构建可转录为dsRNA的植物表达载体转化植物,可实现植物中目标基因的可遗传的基因沉默,用于基因功能鉴定和创造分子育种新材料。

作者课题组此前已经克隆了甘蓝型油菜F3′H基因2个成员、白菜F3′H基因和甘蓝F3′H基因的全长cDNA和基因组序列。目前尚未见有芸薹属F3′H基因植物表达载体构建和转基因研究的报道,本研究构建了芸薹属F3′H基因家族的RNAi载体,将促进芸薹属类黄酮性状的分子机理研究和分子育种。

1材料和方法

1.1材料表面

1.1.1dna的制备

甘蓝型油菜(Brassicanapus)的黑籽保持系5B由重庆市油菜工程技术研究中心提供,其基因组总DNA和生殖器官(蕾、花、开花后10、20、30d的种子)混合总cDNA由此前的研究制备。

大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、根癌农杆菌菌株LBA4404由作者实验室保存。RNA干扰载体pFGC5941(AY310901.1)购自国际拟南芥生物资源中心,pFGC5941M是由本课题组在pFGC5941的基础上改进而成,改进之处是采用来自甘蓝型油菜的BnPAP2基因第2内含子(BnPAP2I2)替换了pFGC5941上过长的PhChsA间隔区,并在间隔区与启动子间增加了一个AatⅡ切点。

1.1.2引物、试剂与仪器

分子试剂均为生物技术级,pMD19-T载体、DNALigationKitVer.2.0、λ-HindⅢDNAmarker为大连宝生物(TaKaRa)产品。Easy-TaqDNA聚合酶及buffer、dNTPs、DL2000plusDNAmarker、琼脂糖等为北京全式金(Transgen)产品。Biospin胶回收试剂盒、Biospin质粒小量提取试剂盒为杭州博日(BioFlux)产品。限制性内切酶及Buffer为MBIFermentas产品。引物合成和测序由上海英骏(Invitrogen)商业完成。分析纯试剂氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、链霉素(Str)等购自上海生工。

1.1.3仪器及检测方法

Eppendorf微量移液器系列(0.1~1000μl)、EppendorfMinispinSpace微量离心机、GenespecI快速核酸蛋白自动分析仪,MJPTC-200梯度PCR仪,DYY-12型电泳仪及水平电泳槽,FR-200A全自动紫外与可见分析仪,超净工作台、恒温振荡器、恒温培养箱、冰箱、水浴锅等。

1.1.4培养基

LB培养基,视载体不同而补充抗生素。

1.2方法

1.2.1