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荣骨颗粒对去势大鼠骨质疏松症的防治作用
骨质疏松症（op）是一种以骨量小、骨结构变化为特征的骨代谢疾病，骨脆弱和骨折的风险增加。OP多发于老年人尤其是绝经后妇女,主要临床表现为胸背部和腰部疼痛、畸形与并发骨折。我院根据传统中医理论及现代中药研究成果,结合名老中医的临床经验制成复方中药制剂荣骨颗粒,在临床应用有效的基础上设计本实验方案,现将实验过程及结果报道如下。
材料和方法
1.实验药物及试剂
选用Wistar大鼠(由中国医学科学院实验动物研究所提供,许可证号:SCXK11-00-0008)79只,体重200～220g,雌性,清洁级。大鼠饲养和实验均在中国中医研究院基础理论研究所清洁级实验动物室内进行(实验动物室许可证号:SYXK11-00-0039)。
(2)药物与配制
药物:荣骨颗粒(由北京中医医院中心制剂室提供)、骨疏康冲剂(东港市康辰制药有限公司生产,批号:010303)、己烯雌酚(北京益民制药厂生产,批号:990404)。
配制方法:实验前,用蒸馏水将各组中西药物配制成以下浓度:荣骨颗粒分别为0.131g/ml、0.262g/ml、0.524g/ml;骨疏康冲剂0.131g/ml;己烯雌酚0.0016mg/ml。
(3)主要试剂与仪器
试剂:盐酸四环素(由华美生物工程公司提供,批号:020061)、戊巴比妥钠(北京通县育才精细化工厂生产,批号:950427)、甲基丙烯酸甲酯(北京益利精细化学品有限公司,批号:960523)、邻苯二甲酸二丁酯(北京化学试剂公司,批号:970628)、过氧化苯甲酰(北京金友化学试剂有限公司,批号。
仪器:德国Reicheit-Jung2040切片机、日本Olympus,BH-2光学显微镜、德国Leica图像分析系统。
2.方法
(1)大鼠骨疏康模型
将79只大鼠随机分为7组:正常对照组11只,模型组11只,己烯雌酚组12只,骨疏康组10只,荣骨颗粒大剂量组(简称大剂量组)12只,荣骨颗粒中剂量组(简称中剂量组)11只,荣骨颗粒小剂量组(简称小剂量组)12只。
模型制作:以45mg/kg的戊巴比妥钠进行大鼠腹腔注射麻醉,腹位固定;在其最末肋骨下、腋中线与距脊柱外侧约1cm之交叉处备皮去毛;以70%的酒精和碘酊消毒后切开局部皮肤、肌肉和腹膜,轻轻将白色发亮脂肪团拉出并分离,暴露卵巢,结扎卵巢下端输卵管,摘除卵巢;缝合切口,外敷消炎粉。同法摘除对侧卵巢。
切除卵巢3个月后,按照大、中、小剂量分别给大鼠灌胃,药液浓度依次为0.524g/ml、0.262g/ml、0.131g/ml的荣骨颗粒1ml/100g(体重),相当于人体5.24g/kg、2.62g/kg、1.31g/kg(体重);己烯雌酚组灌胃,药液浓度为0.0016mg/ml的己烯雌酚1ml/100g,相当于人体0.016mg/kg;药液浓度为0.131g/ml的骨疏康1ml/100g,相当于人体1.31g/kg。各组给药每天1次,连续6d后,休息1d;重复上法给药直至3个月为止。正常对照组、模型组分别以等容积的蒸馏水同法、同期灌胃。
各组大鼠分别于处死前18d、前3d腹腔注射盐酸四环素30mg/kg,对骨进行荧光标记。给药3个月后,处死所有大鼠取血和胫骨进行不脱钙骨切片。
(2)不脱钙骨切片的制备
取大鼠左侧近端1/3胫骨,去除软组织。用乙醇逐级脱水,二甲苯透明,每组各2次,每次24h。浸透液的配制:Ⅰ液:甲基丙烯酸甲酯75ml,邻苯二甲酸二丁酯25ml;Ⅱ液:在Ⅰ液的基础上加过氧化苯甲酰1g;Ⅲ液:在Ⅰ液的基础上加过氧化苯甲酰2.5g。以上3液,用磁力搅拌器充分搅匀。标本在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ液各浸透36h。在青毒素小瓶中注入Ⅲ液约5ml,将标本按同一方向放入瓶中,然后置入40℃烘箱聚合3～4d,待变为无色透明的坚硬包埋块后碎瓶、取出包埋块。修块后,在Reicheit-Jung2040切片机上用钨钢刀分别切出5μm和10μm的纵向不脱钙骨切片。其中5μm切片用二甲苯溶掉树脂后梯度乙醇脱水,用于甲苯胺染色。10μm切片用于荧光观察。
(3)骨小梁的发育情况
按照章明放等的方法,采用LeicaQwin图像分析系统进行骨组织形态计量。
骨小梁组织形态计量:骨小梁体积百分比(TBV%):骨小梁体积占被测骨髓腔总体积的百分比,是骨量水平的主要标志;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不规则、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比;活性生成表面百分比(AFS%):有荧光标记带的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比;骨小梁矿化率(MAR):骨小梁表面荧光双标记带
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