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发酵茯苓的主要活性成分含量测定

椰子茯苓椰子（schw.）wolf是多孔菌科的一种干燥菌核，是去除水分和保湿的重要药物。茯苓又是一种常用的食用菌,在医药和食品工业上应用广泛,年需用量高达12000吨左右。茯苓的获取主要依靠人工栽培和野生采集。由于对野生茯苓的过度采挖,野生茯苓资源已逐渐枯竭,加强野生茯苓资源的保护已刻不容缓。而人工栽培茯苓生产周期长,产量也不高(平均单产仅1.03Kg/窖),且松材消耗量大(以每窖用材10Kg计算,全国每年需耗松材50多万立方),对生态环境造成严重的破坏。因此,面对茯苓旺盛的需求,亟需寻找野生茯苓和人工栽培茯苓的代用品。相对于野生采集和人工栽培,发酵培养可实现茯苓连续地、大规模地工业化生产,缩短生产时间,节省大量的木材,对我国资源和生物多样性的保护有重要的意义。

由于培养基和生长代谢方式的不同,天然茯苓(人工栽培后获得)、发酵茯苓(营养培养基中摇瓶液体发酵后获得)、药性发酵茯苓(药性培养基中摇瓶液体发酵后获得)和复合药性发酵茯苓(复合药性培养基中摇瓶液体发酵后获得)的主要化学成分有所差异。因此,本文测定了不同茯苓的多糖、总糖、氨基酸和微量元素的含量,为加强茯苓质量的有效控制,促进茯苓等药用真菌资源的科学开发与持续利用打下基础。

1实验部分

1.1病毒

茯苓菌株P6冷冻甘油菌由成都医学院药学院生药教研室筛选保存。

1.2仪器、检测方法

超净工作台(苏净集团安泰公司);全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);BeckmanJ2-HS型离心机;SartoriusBP121S型电子天平;氨基酸自动分析仪;FW177型粉碎机;纯水仪(HumanPowerIII);GGX-9火焰原子吸收光谱仪(北京地质仪器厂);WOS-20型无油空气压缩机(天津天伟医疗器械有限公司)。

酵母浸膏、蛋白胨为Oxoid产品;葡萄糖化学对照品(中国药品生物制品检定所);苯酚(须重蒸);K2HPO4、MgSO4.7H2O、NaOH、葡萄糖、盐酸、氯仿、丁醇、乙醇、丙酮、乙醚、硝酸和过氧化氢等试剂均采用国产分析纯;微量元素含量测定实验用水为18.3MΩ高纯水。中药材薏苡仁(CoicisSemen)和枸杞子(LyciiRructus)均购置于杏林大药房,粉碎过60目筛,60℃烘干至恒重后装入有塞瓶中,贴上标签,放入干燥器内备用。

1.3in认为

种子培养基:葡萄糖20g,酵母浸膏4g,蛋白胨5g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.5g,初始pH5.5,蒸馏水1L。1.05kg/cm2,121.3℃灭菌20min。

摇瓶液体发酵培养基:葡萄糖30g,酵母浸膏3.9g,蛋白胨5.1g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.5g,初始pH5.5,蒸馏水1L。

摇瓶液体发酵药性培养基:葡萄糖30g,酵母浸膏3.9g,蛋白胨5.1g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.5g,薏苡仁7.5g,初始pH5.5,蒸馏水1L。

摇瓶液体发酵复合药性培养基:葡萄糖30g,酵母浸膏3.9g,蛋白胨5.1g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.5g,薏苡仁3.75g,枸杞子3.75g,初始pH5.5,蒸馏水1L。

1.4种子溶液的制备

将50mL液体种子培养基装入250mL三角瓶,按0.5%的比例接种冷冻甘油菌,25℃摇瓶振荡培养2d作为液体发酵菌种备用。

1.5培养基培养条件

在250mL三角瓶分别装入摇瓶液体发酵培养基、摇瓶液体发酵药性培养基和摇瓶液体发酵复合药性培养基各50mL,以7%的比例接种种子液,培养温度为25℃,培养基初始pH值为5.5,摇瓶转速为150r/min的培养条件下摇瓶培养7d。

1.6植物病原菌丝球的提取

发酵液6000r/min离心15min后收集沉积的菌丝球,60℃烘干,粉碎过60目筛,60℃烘干至恒重后装入有塞瓶中,贴上标签,放入干燥器内备用。

1.7防水糖和碱性多孔糖的测定

茯苓的水溶性多糖和碱溶性多糖的测定参照参考文献《发酵茯苓菌丝体和天然茯苓多糖的研究》。

1.8总糖的测定

用苯酚-硫酸法测定糖含量,以葡萄糖化学对照品为对照标准品。

1.9氨基酸测定

茯苓氨基酸的测定按中华人民共和国国家标准GB/T5009.124-2003。

1.10变量测定

茯苓微量元素的测定参照参考文献《火焰原子吸收光谱法测定茯苓中微量元素》。

2结果与分析

2.1糖、糖和总糖含量比较

茯苓的多糖和总糖含量测定见表1。发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓之间的多糖和总糖含量差别不大,而发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓的总多糖含量和总糖含量均远低于