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淀粉中产淀粉酶菌株的筛选与鉴定

淀粉酶是一种广泛使用的生物催化剂。它可以应用于食品加工、淀粉糖化和澄清、纺织脱茧、造纸、医药、化学方法、临床医学分析和制药行业。淀粉酶家族包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。α淀粉酶为内切酶,以无规则的方式切开淀粉分子内部的α-1,4糖苷键,而使淀粉生成糊精和低聚糖,是一种钙离子依赖性酶。β-淀粉酶从非还原性末端顺次切下麦芽糖,为外切酶。葡萄糖淀粉酶是一种作用于α-1,4糖苷键的外切酶,从非还原糖末端切下葡萄糖分子。

目前,除开展大量筛选野生型菌种,进行常规的诱变育种之外,国外已初步搞清了产淀粉酶的调控基因,探讨了转导转化和基因克隆的育种技术,将枯草芽孢杆菌重组体的基因引入生产菌株,使淀粉酶的产量提高数倍或数十倍,并已应用于工业生产,给选育高产淀粉酶提供了新的途径。

近年来我国的酶制业工业蓬勃发展,品种和产量也不断增加,但是同国外酶制剂行业尚有一定的差距,并且我国淀粉酶剂型、品种和生产菌种都比较单一。我国淀粉资源丰富,淀粉应用范围广泛,淀粉酶工业发展必将促进我国其他工业的迅速发展,为适合国民经济的发展需要,应进一步扩大淀粉酶的产量和品种。因为每一种淀粉酶都需要特定的温度、pH值,故对淀粉酶活较高的淀粉酶生产菌进行分离和鉴定,有助于发现新的淀粉酶来适应新的工业需要。

1材料和方法

1.试验材料

取自浙江、山东等地各种富含淀粉的土壤,腐败水蜜桃、发霉的玉米和淀粉驯化土壤等18个样品,置于4℃冰箱保存,备用。

1.1.2聚合酶和dnasei

DNA分子标准试剂盒、TaqDNA聚合酶和DNaseI,均来自TaKaRa公司;3,5-水杨酸(DNA),购于华东医药;其余试剂均为分析纯。

1.1.3培养基

1.1.3.1淀粉酶培养基细菌

淀粉10g、硫酸铵10g、氯化钠5g、琼脂18g,定容1L,调至pH为7。

1.1.3.水硫酸钠标准

淀粉10g、酵母膏1.5g、磷酸氢二钾1g、硝酸钠1.5g、七水硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、琼脂13g、链霉素0.0005g,定容1L,调至pH为7。

1.1.3.3液体培养基

淀粉10g、硫酸铵10g、氯化钠5g、硫酸亚铁0.5g、磷酸氢二钾1g、牛肉膏1g,定容1L,调至pH为7。

1.1.3.硫酸亚铁3g

玉米粉0.5g、淀粉0.3g、硝酸钠0.3g、磷酸氢二钾0.105g、磷酸二氢钾0.045g、氯化钠0.01g、硫酸镁0.05g、硫酸亚铁0.003g,pH7.0。

1.1.4仪器

生化培养箱、显微镜、数显酸度计、摇床、紫外-可见光分光光度计、PCR仪、凝胶成像系统、高压灭菌锅。

1.2测试方法

1.2.1发酵液淀粉酶活力测定

取采集到的18份土样,稀释后分别涂布于细菌和真菌初筛平板,置于37℃和28℃下培养24h,形成单菌落,挑选出透明圈较大或明亮的菌落,摇瓶发酵培养,测定发酵液淀粉酶的活力。

1.2.2摇瓶摇瓶

将活化的斜面菌种接种于装有液体培养基的摇瓶中,摇瓶容量250mL,装量50mL,培养温度37℃,摇床转速220r/min,培养24h。

1.2.3培养准备调学瓶

将培养好的液体菌种按体积分数10%的接种量接种于装有发酵培养基的摇瓶中,摇瓶容量500mL,装量100mL,培养温度37℃,摇床转速220r/min,培养24h。

1.2.4dns法用作标准曲线

按参考文献的方法,以葡萄糖作为标准品。

1.2.5nss-pcr反应

取离心处理后的发酵液0.2mL与1mL质量分数1%的淀粉溶液于37℃水浴5min,然后沸水浴5min,终止反应,再加入1mLDNS,沸水浴5min后,迅速冷却,加水2mL,于540nm处测其OD值。以发酵液加质量分数1%淀粉直接煮沸再加DNS试剂反应作为空白对照。

淀粉酶的酶活单位(U):在37℃下,每分钟形成1μmoL/mL葡萄糖所用的酶量为1个酶活单位[1μmoL/(min·mL)]。

1.2.6识别细菌的标记

1.2.6.菌株的鉴别鉴定

筛选到的菌株来源于杭州建德(命名为BSJD10),根据菌株菌落的形态特征、革兰氏染色、生理生化鉴别试验,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版)进行属和种的鉴别。

1.2.6.pcr扩增产物

菌株BSJD10液体培养12h,用上海生工购买的DNA提取试剂盒提取菌株基因。根据细菌16SrDNA中最保守的序列设计引物。引物F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;引物R:5′-AAG-GAGGTGWTCCARCC-3′。PCR反应体系20μL。热循环参数:94℃变性30s,