稳定过表达人SIRT1基因的HEK293细胞系的建立.pdfVIP

18 塞 堕学苤鲞 笙第 鲞 · 基 础 研 究 · 稳定过表达人 SIRT1基 因的HEK293细胞系的建立 林蓉 张凯帆 王维蓉 林琴琴 杨莉娜 任峰 张建丰 摘要 目的：构建人沉默信息调节因子 2同源蛋 白l(SIRT1)基因的真核表达载体，建立稳定过表达人 SIRT1的HEK293细胞 系 方法：将含有 SIRT1的克隆载体 pCRII—TOPO—SIRT1双酶切后 ，连接至真核表达载 体 pcDNA3．1(+)中，连接产物经酶切鉴定后进行测序 构建的重组真核表达质粒pcDNA3．1(+)一SIRT1转染 HEK293细胞 ，G418进行 筛选 ．Real—timePCR和 WesternBlot分别从mRNA和蛋 白水平检测 SIRTl的表达 结果：酶切分析和测序结果证实．SIRT1基因成功插入真核表达质粒pcDNA3．1(+)中。Rea1．timePCR和 WesternBlot结果显示稳定转染pcDNA3．1(十)一SIRTl的HEK293细胞 SIRTI的表达水平明显高于未转染细 胞 (P0．01) 结论：成功构建了真核表达栽体 pcDNA3．1(+)一SIRT1，并建立了稳定过表达 SIRTI基 因的 HEK293细胞 系，为进一步研究SIRTI基因在心血管疾病中的作用及其机制奠定了基础 关键词 心血管疾病： SIRT1： 稳定过表达； HEK293细胞 Establishmentofstableover-expressinghumanSIRT1HEK293cellline L／NRong，ZHANGKai-fan，WANG Wet—rong，LINQing-qing，YANGLi—na，REN ，ZHANGJian舌ng．DepartmentofPhramacology，Schoolof Medicine，XianJiaotongUniversity，X ∞ 710061，China A【bstract】 Objective ToconstructaplasmidexpressinghumanSIRT1andtoestablishHEK293cellline with stableover—expressinghumanSIRT1． M ethods FulllengthofhumanSIRTIgenecDNA wasligatedintoan expressingvectorpcDNA3．1(+)．Afterconfirmedbyrestrictionanalysisandsequencing，therecombinantplasmid wastransfeeted intoHEK293 (：ellsmediatedwith liposome． G418-resistantelonesofHEK293cellswerethen detectedbyreal—timePCR andWesternblotfortheexpressionlevelofSIRT1．Results Theaccuracyofconsturcted and selectedplasmidswasconfirmedbyrestriction enzymaticanalysesand DNA sequencing． Ascompared with untransfeeted HEK293 cells， thelevelsofSIRTImRNA and SIRT1protein oftransfected HEK293 ceilswere significantlyincreased (P0．01)．Conclusions ThepcDNA3．1(+)一SIRT1plasmidissuccessfullyconstructed． HEK293celllinewithstableover—expressingSIRT1isestablished， whichprovidesausefultoolofr