游仆虫EoRab2a蛋白的表达、纯化及定位分析.pdfVIP

第35卷 第4期 水 生 生 物 学 报 Vo1 35，NO．4 2011年 7月 ACTA HYDROBIOL0GICA SINICA July， 201l D0I：10．3724／SPJ．1035．2011．00646 游仆虫EoRab2a蛋 白的表达、纯化及定位分析 许 静 李江姣 聂 宇 梁爱华 王 伟 (山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，太原 030006) 摘要：RabGTPase家族蛋 白是真核细胞 内膜系统转运途径 中重要的调控因子，不同的Rab家族成员在细胞具 有功能多样性。为了解 Rab2的功能，八肋游仆虫EoRab2a基因连接人原核表达质粒 pGEX．6P一1中，获得重 组表达质粒 pGEX．6P一1一EoRab2a。质粒 pGEX．6P．1．EoRab2a转化大肠杆菌BL21(DE3)经 IPTG诱导，大肠 杆菌BL2I(DE3)／pGEX一6P一1．EoRab2a高效表达了可溶性 GST-EoRab2a蛋白。融合蛋白GST-EoRab2a经亲 和层析获得电泳纯蛋白。纯化后的GST-EoRab2a免疫BALB／c小鼠制备多克隆抗体。ELISA和Westem blotting 检测显示制备的抗体效价 1：25600，特异性 良好。免疫荧光定位表明EoRab2a在游仆虫细胞质中点状分布， 推测参与内质网与高尔基体间膜泡转运。 关键词：八肋游仆虫；EoRab2a；原核表达；纯化；免疫荧光定位 中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：1000．3207(2011)04．0646—06 真核细胞 中含有复杂的膜状结构，包括 内质 具有多样性 。研究不同细胞或物种 中的Rab2有助于 网、高尔基体、内涵体、溶酶体和线粒体等器官。 进一步阐明该蛋白的生物学功能。 不同的膜腔中含有不同的蛋白、酶和脂类 。细胞含 八肋游仆虫(Euplotesoctocarinatus)是一种原生 有一套完整的调控体系维持膜结构之间的循环和蛋 动物，属于单细胞真核生物 引【，我们从八肋游仆虫 白在它们之间的转运。RabGTPase家族蛋 白是细胞 大核基因组中克隆到一种编码 Rab2蛋白同源物的基 中重要的囊泡转运调控因子。在高尔基体顺面膜囊 因，命名为EoRab2a(GenBank登陆号为EU365390)I。 和 内质网之间经常存在一些大小不等的膜泡结构， 为了解Rab2的功能，本研究对EoRab2a基因的编码 称之为管状膜泡簇(VTCs，vesiculartubularclusters)， 蛋 白进行了原核表达、纯化，利用纯化的蛋白制备 这些膜泡介导了内质网(ER)和顺面高尔基体之间的 了多克隆抗体，并对抗体的特异性进行了检测，激 物质运输。在哺乳动物细胞中，Rab2结合于 VTCs 光共聚焦免疫荧光定位表明该蛋 白定位于细胞质 中， 表面，介导可溶性分子 的募集，实现了蛋 白质的循 暗示游仆虫中EoRab2a可能参与内质网与高尔基体 环利用，在分泌途径早期的膜运输中发挥重要作用l『】。 间的膜泡转运过程。 近年来，Rab2蛋白一些新的功能被逐步认识：在线 1 材料与方法 虫的神经细胞中 Rab2蛋 白参与神经细胞 的分化调 节，并参与控制线虫的运动 2【，3；在线虫的吞噬细胞 1．1 菌株及质粒 中负责凋亡细胞的清 】；在烟草的花粉管中参与 八肋游仆虫f德国明斯特大学 K．Heckman教授 花粉管的生长调节[5：在牛的精子细胞中促进精子 惠赠)由本实验室培养；大肠杆菌(Escherichiacoli) 的生物发生 o【；在人类肿瘤细胞 中参与调控肿瘤 的 DH5a及大肠杆菌BL21(DE3)为本实验室 自行保存； 发展r。可见，Rab2在不同细胞或