间接ELISA检测鸡痘抗体地研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 间接EL|sA检测鸡痘抗体的研究 王雪鹏1，刘悦竹2，张春兰2，常维山1 71 (1山东农业大学动物科技学院，山东泰安，2019；2山东省明发兽药研究所，山东济南．250001) 鸡痘病毒属痘病毒科禽痘病毒属，可引起皮肤型或／和粘膜型鸡痘，皮肤型鸡痘症状轻微，死亡率较 低，粘膜型鸡痘症状较重，有时可引起较高的死亡率。 由于近年来局部地区鸡的养殖密度不断增加，环境污染不断加剧，又由于全年各个季节均有育 雏，而鸡痘疫苗的免疫保护期较断，并且缺乏免疫监测手段，导致鸡痘的发病率、死亡率及其造成 的损失有增高趋势。 为建立鸡痘抗体检测方法，我们建立了间接ELISA检测鸡痘抗体的方法，现报告如下： 1．1材料和方法 1 材料 1．1病毒毒株与血清 鸡痘病毒野毒株：山东明发兽药研究所提供。 鸡痘弱毒疫苗：齐鲁动物保健品厂生产。 鸡痘蜂胶佐剂灭活菌：山东省明发兽药研究所研制。 鸡痘阳性血清：山东农业大学提供。 SPF阴性血清：山东农业大学提供。 HRP酶标兔抗鸡血清IgG：购自中国联星公司为美国SIGMA生产。 酶标板：浙江省临海市华威分析仪器有限公司生产的96孔聚氯乙烯塑料反应板。 1．2ELISA抗原制备 将鸡痘病毒地方株和弱毒株分别接种10日龄鸡胚尿囊膜，孵化5天后收集有明显痘斑的尿囊膜， 剪碎后加4倍量的生理盐水匀浆，反复冻融三次，超声波破碎。2000转／分，离心10min。 留上清夜备用。 1．3待检血清 1．3．1实验免疫动物血清 将18只60日龄的商品代蛋鸡随机分成3组， 第一组为弱毒疫苗组：翅下刺种鸡痘弱毒疫苗。 第二组为灭活和弱毒疫苗组：翅下刺种鸡痘弱毒疫苗，然后，颈部皮下注射灭活苗0．2ml／只。 第三组为灭活疫苗组：颈部皮下注射灭活苗0．2ml／只。 免疫前和免疫后20日，每只鸡分别采血2ml，分离出血清备用。 1．3．2康复鸡血清分离 某实验鸡群自然感染鸡痘后2周血清。 1．4ELISA方法 抗原包被：用0．05M 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 100ul，4℃过夜。 对照。置37℃的湿盒内反应1小时。 作用1小时。 加底物溶液：每孔加IOOulOPD底物液，37*(2避光作用20分钟。 l。 p 终止反应：每孔加2MH2SO。50 结果判定：测OD值，并计算出p／N，P／N≥2．1，且OD值超过0．2的样品为阳性。 1．5琼脂扩散试验按参考文献进行，将待检血清连续2倍稀释至24，中央孔加抗原，外周孔加待检 血清及阳性和阴性对照血清。 2．结果 2．1抗原性质 接种鸡痘毒中的尿囊膜上可见巨大痘斑负染超薄切片电镜观察可见大量直径为200—300纳米的哑铃 形病毒颗粒。蛋白含量：抗原液蛋白质浓度为0．23mg／ml 2．2实验免疫动物血清抗体检测结果，不同鸡痘抗原鸡群后，鸡群血清中抗鸡痘病毒抗体检测结果见 表1和表2。 2．3 康复鸡群血清抗体的检测结果，康复鸡群血清抗鸡痘病毒抗体ELISA检测结果见表3和表4 表1鸡痘弱毒苗、弱毒菇与灭活苗、灭活茁ELISA检测结果 f编号 蜗毒苗OD值 剥毒与灭活苗01)值 灭活苗OD位 对m{组01)值 免疫前 免疫厉 免疫前 免疫届 免疫前 免疫后 阳性埘照 阴性对j|c【 }， n916 2．286 n772 Jj30 n692 J．873 。，n2 z l103 2．159 0726 0．846 2 562 。，，s 3 0．720 1．271 0775 2．043 0930 2．528 。．。％ 『。