LPS对乙肝肝衰竭患者PBMC分泌细胞因子功能的影响.pdfVIP

第五届中国病毒性肝炎与艾滋病实验室诊断与临床高峰论坛 常规复苏 PBMC ，将得到的PBMC 分为组， 室温下震荡重悬，将 96 孔板置入 Luminex 200 （1）未刺激组；（2 ）LPS 刺激组，培养 2 小时 内检测。所用的试剂及仪器均购自美国 luminex 后，LPS 刺激组加入 LPS20μl，LPS 终浓度为 100 公司。 ng/ml 。未刺激组加入空白培养基，共孵育24 h 四、血浆LPS 的检测 后，收集培养上清进行相关检测。 采用鲎实验检测血浆中 LPS 的含量。试剂 三、Luminex 检测培养上清中 TNF-αIFN 和仪器 MB-80 微生物快速动态检测系统均购自 -γIL-6 的含量 北京金山船科技有限公司。 Bio-Plex 悬液芯片的核心技术是把微小的 五、统计学分析 颗粒即微球（bead 或 microsphere ）按照严格的 采用 SPSS16.0 进行统计学分析，首先进行 搭配比例掺入两种不同的红色分类荧光染料，根 正态性检验及方差齐性检验，发现各组数据均成 据比例不同可以把微球分类为 100 种，每种微球 正态分布且方差齐则采用单因素方差分析，采用 上再标上不同的探针分子，从而可以对一个样本 LSD 法进行组间两两比较，检验水准 P ＝0.05 。 中多达 100 种不同的目的分子进行同步检测。具 对空白组与刺激组比较采用 t 检验，P ＜0.05 为 体的操作是把标记了抗体的微球 50μl 加入预先 差异有统计学意义。 封闭好的 96 孔板上，然后分别加入待检测样品 和标准品，室温孵育 3 h 。用真空泵轻轻吸走残 结 果 留液体，每孔加入 100 μl Wash Buffer 进行清洗， 一、PBMC 分泌 TNF-α、IFN-γ 及 IL-6 功 洗涤 3 次，每次洗涤中间用真空过滤去除 Wash 能检测： Buffer ，用吸水垫或滤纸吸干板子底部的残留液 直接培养乙肝肝衰竭、慢性乙肝及健康对照 体。 然后加入种生物素标记二抗 50ul，室温下 组 PBMC 细胞，不给予任何刺激，体外培养 24 h 作用 1 小时。如上再次洗板 3 次，加入荧光素标 后检测培养上清中 TNF-α、IFN-γ及 IL-6 浓度， 记抗生物素抗体 60ul 混匀，室温下作用 30 分钟。 结果如表 1。 加入 100μl Wash Buffer，微量振荡器 500 r/min 表 1 Luminex 检测 PBMC 体外培养上清中细胞因子的浓度（pg/ml ） 分组 TNF-α IFN-γ IL-6 健康对照组 350 ±190 5.53±4.86 4532 ±538 慢乙肝组 504 ±226 0.58 ±0.59 15 587 ±2983 乙肝肝衰竭组 2729 ±778 33.97 ±14.33 30 415±8132 比较培养上清中 TNF-α 的浓度，乙肝肝衰 ＝0.000 ）及正常组（LSD ＝28.44 ，P ＝0.000 ）， 竭组 TNF-α含量明显高于慢性乙型肝炎组（LSD 慢性乙型肝炎组与正常组间差异无统计学意义 ＝2225.5 ，P ＝0.000 ）和健康对照组组（LSD ＝ （LSD ＝-4.95，P ＝0.216 ） 2379.78 ，P ＝0.000 ），慢性乙型肝炎组与正常组