葱白提取物对脂肪变性肝细胞核因子κB、TNF-α表达的影响.pdfVIP

基因序列t用研n咐5．0软件设计扩增引物l GAPDHll3 引物为： GAPDHll3．螂m： Rev封TraACe-a-12“-RT-PCR Kit逆转录试剂盒，按操作说明将组织总RNA中的mRNA逆转录成 cDNA，再进行P味扩增，扩增参数：95℃预变性5min．95℃20，_+卯．5C20s_+72℃30s．共35 个循环．7TC延长3rain。电泳结果用Quantlly 以正常组为单位1．作柱状圉。 1．26WFstem瑚a嘧堪技束检涌肝细胞棱圆子NF．b蛋白韵表达同上．提取备组细胞总蛋 白，细胞桉裂解液裂解，取20山裂解样品液，进行SDS蛋白电泳，表达产物电转移至硝酸 纤维素膜上．进行Wesmm-lot反应，通过BendScan 5．0软件对杂交图进行分析，以B-actin做为 定量Marker。20pmol为定量单位． mobil．竹shiR 1工．电泳迁移率改变分析(ele曲ophoretic EMSA检测参照试剂盒说明书进行。提取细胞核内容物，并检测NF-v．B的活性．同步检测上述各 组细胞棱蛋白与Biotin标记的NF-r．B序列探针(sense sense 3-…舢GIm00AT…-BIOTIN 5’，备02umolAd)的结台活性；同时，通过采用无标记的 NF-r．B(seme5-…TAGCATATGCTA…-3’，anti-sense 验。进行葱白提取物对NF．出与DNA结合抑制作用的特异性分析。应用BandScan5．0对所形成 的特异性产物条带计算积分光密度分析。以葱白提取物作用组与阴性对照组的结台条带IOD的比 值表示葱白提取物作用组的相对结合活性． 】工8检测各组培养上清中1NF吨吉量收集各组在培养箱中培养24h后的培养上清．用人 TNF-nELISA试剂盒分别检测其中1NF吨的浓度． 】3统计学处理 所有数据均用SFSS-14．0软件包进行统计学分析。计量资料以F±嚷示。问比较采用t检验。 二、结果 I．镜下形态观察和油红O染色结果正常组细胞边缘清晰，呈多角形排列呈铺路石样，细胞问 结合紧密t无缝隙．油红O染色示细胞边缘清晰，核大，细胞内少见橘红色脂滴聚集；模型组细 胞边缘清晰-太部分多角形。有些细胞变圆，细胞问结合欠紧密．油红O染色示细胞内橘红色脂 滴较多，部分细胞内腊滴成环执位于细胞膜内储．可见较大的脂滴。表明成功建立了肝细胞脂肪变 性模型，见固l。 墓麓懋 ^：正常对照组 B：模型组， 围I不同浓度葱白提取物对庸肪变性细胞细胞脂肪沉积的影响(油红O染色x400)， 上脂肪酸剂对跑内甘油三酯含量的影响培养24h后，脂肪酸剂使细胞内TG舍量明显增加 脂肪肝患者和动物NAFL模型特征．见表l。 ·286· 襄1脂肪酸剂胞内甘油三酯吉量的影响(j岛-n=8) 与正常组比较．##P0．01， 3．不同浓度葱白提取物对脂肪变性细胞NF-r,BmRNA表达的影响 21、254A2、153．81、14086、11763 常对照组、模型组，低、中、高浓度各组平均CT值分别为121 呈剂量关系。 4．不同浓度葱白提取物对脂肪变性细胞NF-scB蛋白表达的影响 58、5822、5635、 17、76 正常对照组、模型组，低、中、高浓度各组平均CT值NF-r,B分别为2l 46．26，将药物作用各维与模型组比较．表明葱白提取物能降低脂舫变性细胞NF-IcB的蛋白表达， 且存在剂量关系。 f；I：… 『?—1 i——J 【．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．