猪囊尾蚴cYI因的原核载体构建及表达.pdfVIP

中文摘要 猪囊尾蚴cYI基因的原核载体构建及其表达 摘 要 目的：本研究采用基因重组技术，拟构建猪囊尾蚴cYI 基因的原核表达载体，观察其在大肠杆菌中的表达情况及其 抗原特异性，为进一步研究eYI基因的蛋白质结构和功能， 从而为开发囊虫病特异性诊断抗原和基因疫苗提供理论依 据。 方法：1．目的基因的获得：以本室克隆的保存在质粒内 min，94℃ 扩增，同时设立对照组，条件为：94。C预变性5 变性lrain，56℃退火1rain，72℃延伸lrain，30个循环结束， 72℃延伸10 经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化，经EcoRI及HindlII末端修 饰后与经相同酶消化、回收的原核高效表达载体PMAL．C2 DH5ct，同 进行体外定向重组，连接产物转化感受态E．coli 体培养基中培养，根据B．半乳糖甘酶的Ⅸ互补原则筛选重 组子，挑选白色菌落，按碱裂解法提取质粒后进行双酶切， 鉴定是否含有插入片段。3．重组表达：将含有目的基因的重 h。 分别于诱导前，诱导后1、2、3、4、5、6 h取菌液lml，离 中文摘要 心，收集菌体并用TEBuffer悬浮。4．表达产物的蛋白电泳 PMAL．C．cYI离心收集菌体，置混旋器上振荡重悬，然后超 声破碎菌体，分别收集上清和沉淀，取少量收集到的上清及 沉淀分别加入等体积的2xSDS凝胶加样缓冲液混匀后煮沸 并以蛋白质低分子量maker作为标准。电泳结束后用考马斯 亮兰对凝胶进行染色和脱色。将脱色后的凝胶照相。5． Westem blot分析：将诱导前后的重组体及诱导后的空载体表 硝酸纤维素膜上，通过丽春红染色，观察转膜是否成功，同 时参照蛋白分子量标准，确定是否含有靶蛋白，将膜沿电泳 条带方向剪成数条后用5％脱脂奶粉封闭，然后与一抗(稀 释的囊虫病病人血清，正常人血清和阴道毛滴虫病人血清) 抗体)37。C反应1h，最后用底物溶液4．氯．1一萘酚过氧化氢系 统显色，观察显色结果6．重组蛋白的大量获得：将含有 5h，离心收集菌体，超声破碎后溶于适量TE中再经滤器过 虑除菌、纯化，紫外分光光度计测OD260定量，．20℃保存 备用。 结果：根据己知cDNA序列设计引物，进行PCR扩增 后酶切鉴定DNA片段的大小，紫外灯下可见一条约550bp 的特异条带，与预期大小相吻合。将该片段与表达载体 PMAL．C2分别经双酶切后体外重组转化大肠杆菌，经蓝白斑 筛选后获得含重组质粒的阳性克隆菌。重组质粒经 中文摘要 期设计。将上述阳性质粒转化宿主菌进行诱导表达，表达产 物经超声破碎，离心后分别收集上清和沉淀进行SDS．PAGE 电泳，结果表明该融合蛋白主要以包涵体形式存在于细菌裂 解物的沉淀中，同时设置空载体表达产物对照，并参照分子 量标准，可以看出，未插入目的基因的PMAL．C2／DH5Ⅸ只 cYI，分子量约为60KD，与预期大小相符。同时经凝胶图像 系统分析，该蛋白表达量约占菌体蛋白总量的28％。再经 60KD的表达产物位置出现单一显色条带，而未经诱导的菌 体、空载体蛋白以及以两阴性对照血清为一抗的反应，在相 应位置均无反应条带出现，表明目的片段可与囊虫病病人血 清特异性结合。 结论：(1)本实验成功构建了cYI的原核表达重组质粒 验表明，目的片段可与囊虫病病人血清产生特异性免疫反 j立。 关键词：猪囊尾蚴；原核表达；大肠杆菌；融合蛋白； SDS—PAGE：Westemblot 英文摘要 VectorConstructAnd Of