第三章 液相色谱法 仪器分析教案.doc

第三章 液相色谱法 第一节 概述 20世纪的后二十年，LC的应用发展非常迅速。 生命科学、生物工程的发展，迫切需要解决高沸点、强极性、热不稳定性、大分子复杂混合物的分离分析。 高效液相色谱法是强有力手段之一。 80年代以来HPLC（到1998年统计）文献量 占21%（89年）；仪器销售量 25%（12亿）（89年）。 应用领域： 拓展得非常广（化工、环保、临床、药品、生命），超过GC。 1.1 液相色谱的适用范围 适合用HPLC分析的样品特点： A 能制成溶液的有机物； B 高沸点（400℃及其以上）； C 热稳定性差； D 相对分子质量大（大于400）。 这样的物质几乎占有机物总数的75%~80%。 高效液相色谱的应用越来越广泛。 高压：液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压，一般可150~350×105Pa。 高速：分离所需时间短，载气流速快（1~10mL/min）。 高效：柱效高，可达3万塔板/米。气相柱效为 2000塔板/米。 高灵敏度： 1、紫外检测器灵敏度可达10-9g，荧光检测器可达10-11g。 2、所需样品少，微升数量级的样品足以进行全分析。 1.3 高效液相色谱固定相 按液相色谱法的分类来介绍固定相 1. 液-液分配及离子对色谱固定相 （1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料； （2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体） 30～40μm的实心玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量低，故需配灵敏度较高的检测器。目前粒度为5～10μm的全多孔微粒是使用最广泛的高效填料。 （3）化学键合固定相 化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N 化学键合固定相的特点： （1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （5）有利于梯度洗脱； 存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主； 2.液-固吸附色谱法固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：目前常用5～10 μm的硅胶微粒； 3.离子交换色谱固定相 结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂：薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂。 （2）离子交换键合固定相：薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）。 上述两种树脂按分离特点又可分为两类，即阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）和阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。 按离子交换功能团酸碱性强弱分类: 强酸性、弱酸性；强碱性、弱碱性。 由于强酸或强碱性离子交换树脂比较稳定，pH值适用范围较宽，因此在高效液相色谱中应用较多。 4. 空间排阻色谱固定相 （1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。 1.4 高效液相色谱固定相 1. 流动相特性 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）正相色谱——亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 反相色谱——若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 3. 流动相的选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极