从土壤中快速提取纯化DNA方法的建立.pdfVIP

第32卷／gg 1期／ 河北师范大学学报／自然干斗学版／ Vot．32 No．1 2008年1月 JOURNAL OF HEBEI N0RMAL UNIVERSITY／NaIuraI Science Edition／ Jan．2O08 从土壤中快速提取纯化DNA方法的建立 栗若兰 ， 郑智慧 ， 张 华 ， 路新华 ， 赵宝华 ， 贺建功 (1．华北制药集团新药研究开发有限责任公司微生物药物国家研究工程IfJ心，河北石家庄 050015 2．河北师范大学 生命科学学院，河北石家庄 050016) 摘 要：比较了从土壤中提取及纯化DNA的不同方法，确立了TENS一乙酸铵提取方法和PVPP柱层析的纯化 方法．结果显示：TENS一乙酸铵提取方法对不同土壤均有较好的提取效果，DNA片段长度在23．1 kb以上，且无明 显降解；PVPP柱层析的纯化方法比胶回收纯化方法的DNA回收效率高、质量好，可用于PCR扩增． 关键词：土壤微生物；DNA提取；DNA纯化；PCR 中图分类号：Q939．96 文献标识码：A 文章编号：1000—5854(2008)01—0098—03 在传统微生物学中，研究利用微生物首先要进行分离培养．由于土壤微生物生态系统极为复杂及培养条 件的限制，目前可在实验室培养的微生物还不到自然界中微生物总数的1％，还有相当多的菌种因无法人工 培养而未被人类所认识n J．随着分子生物学的发展和研究手段的更新，人们现在已经有可能绕过微生物菌 种分离培养这一步骤，直接在基因水平上研究和开发未培养微生物资源_2 J． 在基因水平上研究土壤微生物的技术关键之一是获得高浓度、大片段、多样性程度高、具有代表性并且 可进行分子操作的土壤微生物混合基因组DNA．由于土壤成分复杂、不同土壤样品之问差异较大，微生物仅 为其中极小的一部分_3j，并且微生物细胞通常紧密吸附于土壤颗粒表面，因此，从土壤样品中高效地获得 DNA具有相当难度．另外，由于土壤中通常含有较多的可与DNA共同提取出来的物质，如腐殖酸、重金属离 子等，这些物质会影响对DNA进行分子操作[3,4 J，使纯化DNA较为困难．因此，建立土壤DNA的提取纯化 方法对于在分子水平上研究土壤微生物具有重要意义_5 J． 目前从土壤中提取DNA的方法可分为直接法和间接法2类．直接法采用原位裂解土壤微生物的方法， 回收后做DNA纯化；间接法采用差速离心回收菌体，裂解菌体回收DNA并纯化．直接法裂解微生物细胞包 括以下几种方式：加热、表面活性剂、酶解、酚、硫氰酸胍、EDTA、反复冻融、超声处理、微波加热、玻璃珠破碎 等【6 J．其中一些方法虽然能够得到较好的提取效果，但步骤繁琐，且需要专用仪器．本文中，笔者比较和改进 了从土壤中提取及纯化DNA的几种方法，建立了一套高效、快速、简便的方法，对土壤微生物代谢产物的基 因筛选研究提供基础． 1 材料与方法 1．1 材 料 土样采自全国各地不同生境的土壤样品，保藏于4℃，取样时随机抽取． 1．2 方 法 1．2．1从土壤提取DNA方法比较 方法1(TENS—PVP法)[7 J：0．5 g土样中加入2 mL清洗液(50 mmol／L Tris，pH 8．0；200 mmol／L NaCI； 5 mmol／L EDTA；0．5 mL／L TritonX一100)，涡旋，8 000 r／min离心10 min，弃上清；加2 mL 2倍TENS(100 mmol／L Tris，pH 8．0；40 mmol／L EDTA；200 mmol／L NaCI；100 g／L SDS)，0．5 mL玻璃珠(直径425～600 m，Sigma)，涡旋10 min，加20 L蛋白酶K(25 g／L)，70℃水浴30 min，每10 min涡旋1次；混合物分别置 于一80℃冷冻，80℃水浴，循环2次；室温静置几分钟，12 000 r／min离心10 rain，收集上清置于冰上；沉淀中 加2 mL PVP溶液(50 mmol／L Tris，pH 8．0；25 mmol／L EDTA；30 g／L SDS；12 g／I PVP)，涡旋10 min，80℃ 收稿El期：2007～10—11；修回日期：2007—11—12 基金项目：石