高氧肺损伤形成过程中小窝蛋白1、tgfβ1表达关系的体内外研究-study on the expression of caveolin 1 and tgf β 1 during hyperoxia lung injury in vivo and in vitro.docxVIP

，: I川111:川II I III IIIII /IIIIIIIIIl Y1889?48高氧肺损伤形成过程中小窝蛋白斗、 TGF-?l 表达关系的体内外研究摘要目的:通过建立高氧肺损伤动物模型和体外细胞培养的方法，从体内和体外两方面来研究小窝蛋白 -1(Caveolin-l )和丁GF币1与高氧肺 损伤纤维化之间的关系，以探讨高氧肺损伤纤维化的发病机制。方法:1.体内实验将削宫术取出孕 21d 大鼠作为早产鼠为研究对象，制成早产鼠高氧肺损伤模型。实验将早产大鼠分为两个组:对照组(n=15 )、实验组 (n=15) 。两组分别于暴露满1、3、7d 时随机选取 早产鼠 5 只麻醉后处死，行肺漉洗后，将肺组织完整取出后制成石蜡 切片，应用苏木精.伊红染色观察不同时间点肺组织病理改变，在光 镜下进行肺组织纤维化评分，并采用免疫组织化学 SP 法(链霉菌抗生 物素蛋白帽过氧化物酶连结法)检测不问时间点肺组织小窝蛋白 -1 、 丁GF-?l 的表达部位和强度。2.体外实验以人肺上皮细胞系 A549 为模型细胞，建立商氧 A549 细胞损伤模型。实验将细胞随机分为对照组和实验组。对照组置于 5%C02 培养箱中:实验组置于 5%C02--95 %02 的混合气中培养。两 组分别于处理后 12、24、48h 收集细胞检测如下指标:普通光学显微 镜下观察细胞形态学变化:采用免疫荧光双染检测小窝蛋白 4 、 TGF-?l 表达的相关性，用激光扫描共聚焦显微镜观察。结果$1.体内实验结果 (1)肺组织病理改变 t 对照组 1、3、7d 比较，肺 组织发育逐渐成熟，肺炮结构逐渐规犁，大小均匀一致，肺泡间隔变 薄，各时间点肺组织形态无明显改变。与对照组比较，高氧暴露第ld ，无较大差异:高氧暴露第3d ，肺泡腔内有少许红细胞渗出及肺 泡问阳有以中性粒细胞为主的浸润:高轼暴露第泪，肺损伤较茧， 可见较多的炎性细胞和红细胞，肺发育受阻，肺组织结构紊乱，出现 肺纤维化倾向。 (2)肺组织小窝蛋白幽 1 TGF-? 1的表达2 小窝蛋白-1 在对照组早产大鼠肺组织中均有较高水平表达。与对照组相比，实验 组肺组织 Caveolin斗的表达出现降低，在 3d，7d 明显降低，差异有 显著性(31.21土4.04 vs 46.20:1:3.50; 19.94土5.58 vs 43.26土4.12 ，P0.05) ，其与纤维化评分呈负相关(严嗣 0.88、-0.93 ，P0.05); 丁GF-?l 在对照组早产大鼠肺组织中均有较低水平表达。与对照组相比，实验组肺组织 TGF-?l 的表达出现升高，在 3d ，7d 明显升高，与对照组比较差异有 显著性 (20.45:1:2.75vs16.53:1:1.69; 35.78土2.28vs 17.05:1:3.42 ，PO.05) ，其与纤维化评分盟正相关(严 0.82、0.87，P0.05) 。相同时间点小窝蛋 白斗的阳性表达与 TGF-仰的阳性表达有负相关，以对照组，实验组 ld、7d 最显著(r=-0.91 ，幽0.86 ，-0.63 ，幽0.82 ，P0.05) 。2.体外实验结果。)A549 细胞形态变化:倒置相差显微镜下观察， 对照组 A549 细胞贴壁良好，为扁圆的多角形，细胞排列紧密，连接 成片，胞体明亮，数量多，悬浮细胞较少，呈现良好的生长状态。实 验组细胞受损明显，由典型的扁困多角形细胞变为圆形成椭圆形，细胞问空隙加大，连接松散，活细胞数量明显降低，悬浮细胞明显增多，以通高氧 48 h 最明显。 (2)免疫荧光双染结果显示:小窝蛋白」免疫 荧光阳性细胞里红色荧光， TGF-?l 免疫荧光阳性细胞盟绿色荧光， 两者合成显示黄色荧光。在对照组，小窝蛋白 -1 的高表达伴随着 丁GF-?l 的低表达(44.25:1:3.23 vs 10.18:1:2.74); 在实验组，随着通氧时 间的延长，小窝蛋白-1 表达逐渐减弱， TGF币1 表达逐渐增强 (12h: 35.25 士1.88 vs 17.32 士1.50; 24h: 20.75 士 1.68 vs 26.5 1士1.82; 48h:9.86 士 2.80 vs 41.94 土 4.47)。相同时间点小窝蛋白斗的阳性表达与 TGF币1 的阳性表达有负相关，以对照组、实验组 48h 最显著(严刷0.91，-0.62 ，-0.53，-0.88 ，P0.05) 。结论:在南氧肺损伤的发生发展过程中， Caveolin斗表达显著性 减少， TGF币1表达持续性增多，两者里拈抗关系，提示 Caveolin-l 可 能通过下调丁Gι阳的产生而具有抗纤维化能力。关键词t 高氧肺损伤:小窝蛋白 -1 ;丁GF-?l