Th17和Treg细胞对帕金森病模型小鼠的神经炎症和多巴胺能神经元损伤的作用及其机制分析-人体解剖与组织胚胎学专业论文.docx

Th17 和 Th17 和 Treg 细胞对帕金森病模型小鼠的神经炎症和多巴胺能神经元损伤的作用及其机制研究 中文摘要 中文摘要Th17 中文摘要 Th17 和 Treg 细胞对帕金森病模型小鼠的神经炎症和多巴胺能神经元损伤的作用及其机制研究 Th17 和 Treg 细胞对帕金森病模型小鼠的神经炎症和多巴 胺能神经元损伤的作用及其机制研究 中文摘要 目 的 辅助性T（helper T, Th）17 细胞和调节性T（regulatory T, Treg）细胞是上世纪末 被证实的两种CD4+ T细胞亚群。已有报道说明，Th17 细胞具有很强的致炎症作用， 在慢性炎症和自身免疫性疾病中发挥重要作用，而Treg细胞具有明显的免疫抑制作 用，在免疫耐受和免疫稳态中起重要作用。近年来的研究表明，神经退行性疾病--帕 金森病（Parkinson’s disease, PD）的发病机制中也涉及了神经免疫的紊乱，主要表现 为脑内小胶质细胞（固有免疫细胞）的过度激活导致了神经炎症，继而诱发和加重了 PD的病理过程。然而，关于Th17 和Treg这两种适应性免疫细胞在PD中的作用及其机 制仍然知之甚少。为此，本研究探讨Th17 和Treg细胞对PD的神经炎症和多巴胺能神 经元丢失的作用，并且从胶质细胞激活介导和神经元直接接触分子这两个方面揭示 Th17 和Treg细胞的作用机制。研究可为临床上解释PD的发病机制和设计PD的防治措 施提供新的实验依据。 方 法 1. PD 小鼠模型的制作：7-8 周龄的 C57BL/6 小鼠腹腔注射 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6- 四氢吡啶（1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP），20 mg/kg/次，共注射 4 次，每次间隔 2 h，制备 PD 小鼠模型。未作任何处理的小鼠和腹腔注射等量生理盐 水的小鼠作为对照。 2. PD 模型小鼠的评价：在 MPTP 末次注射后的第 2 天和第 7 天，用转棒、爬杆 和旷场试验观察动物的运动和行为学变化；用免疫荧光组织化学染色法观察小鼠中脑 黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的免疫反应阳性神经元的数量；用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）检测纹状体内多巴胺（dopamine, DA）的含量。 I PAGE PAGE IV III III 3. PD模型小鼠Th17 和Treg细胞渗入脑实质的检测：在MPTP末次注射后的第 2 天和第 7 天，将FITC结合的白蛋白经心脏注入血液循环，观察小鼠SNpc中FITC结合 的白蛋白的渗漏情况来判断血脑屏障的完整性。并且，应用免疫荧光双标染色法检测 在SNpc中CD4 与Th17 细胞的核转录因子--维甲酸相关孤儿受体γt（retinoid-related orphan nuclear receptor γt, RORγt）共表达的细胞，及检测CD4 与Treg细胞的核转录因 子--叉头蛋白p3（forkhead box p3, Foxp3）共表达的细胞。 4. PD模型小鼠脑内Th17 和Treg细胞功能失衡的检测：在MPTP末次注射后的第 2 天和第 7 天，应用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测中脑黑质中，Th17 细 胞的特异性转录因子RORγt及致炎细胞因子--白介素（interleukin, IL）-17 和IL-22 的 表达；并检测Treg细胞的特异性转录因子Foxp3 及抗炎细胞因子--转化生长因子 （transforming growth factor, TGF）-β和IL-10 的表达。应用免疫荧光双标技术观察 IL-17 和TGF-β在Th17（RORγt+）细胞、Treg（Foxp3+）细胞、神经元（NeuN+）、小 胶质（CD11b+）细胞和星形胶质（GFAP+）细胞中的表达和定位情况。 5. PD模型小鼠脑内存在胶质细胞介导的神经炎症的检测：在MPTP末次注射后的 第 2 天和第 7 天，应用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测中脑黑质中，炎性介 质--肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α、IL-1β、干扰素（interferon, IFN） -γ和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）的表达，以及神经营 养因子--胶质细胞源性神经营养因子（glial cell derived neurotrophic factor,