戊四唑诱导斑马鱼癫痫模型优化及评价指标.docVIP

戊四唑诱导斑马鱼癫痫模型优化及评价指标 　　摘要：目的探讨建立PTZ诱导斑马鱼癫痫模型的方法，优化PTZ诱导浓度及评价指标。方法在斑马鱼PTZ诱导癫痫模型中，分别对不同浓度PTZ（1.25、2.5、5、10、20、30 mM）、不同的观察指标（快速运动距离、中速运动距离、慢速运动距离、总的运动距离）进行分析。结果PTZ在10 mM浓度下快速运动距离（V20 mm/sec）与溶剂组相比，差异显著（P20 mm/sec）的改变作为药效评价指标。结论斑马鱼PTZ诱导癫痫模型中， 10 mM PTZ为最佳诱导浓度，快速运动距离的改变为最佳的药效评价指标。 　　关键词：戊四唑；斑马鱼；癫痫；药学评价戊四唑（Pentylenetetrazole, PTZ）是γ-氨基丁酸（简称GABA）抑制剂，GABA是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经物质[1,2]。研究表明，大剂量的PTZ可诱导癫痫发作，是哺乳动物癫痫模型中的常用诱导剂[3,4]。最近，采用PTZ诱导斑马鱼癫痫模型的成功建立，为天然药物的药学评价和药物筛选创造了更为有力的条件[5,6]。但斑马鱼癫痫模型的优化及评价指标存在很多的争议[5]。 本实验探讨建立PTZ诱导斑马鱼癫痫模型的方法，优化PTZ诱导浓度及药学评价指标，为高通量的天然药物筛选提供更为有力的实验证据。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行。每次交配准备4~5对成年斑马鱼，平均每对能产200~300个胚胎。在受精后6h（即6 hpf）和24 hpf 对胚胎进行清理（移除已死亡胚胎），并根据胚胎的发育阶段挑选合适的胚胎。解剖显微镜（SMZ645，Nikon公司）；48/96孔板（Nest Biotech）；行为分析仪（V3，ViewPoint Life Sciences公司）；二甲基亚砜（DMSO，阿拉丁，批号1095515）；戊四唑（Pentylenetetrazole，PTZ）购自美国sigma公司，批号069K1245。 　　1.2方法在 28 ℃ 条件下用养鱼用水孵育胚胎（养鱼用水水质：每1L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为 480~510 μS/cm；pH 为 6.9~7.2；硬度为 53.7~71.6 mg/L CaCO3）。 在斑马鱼PTZ诱导癫痫模型中，分别对不同浓度PTZ（1.25、2.5、5、10、20、30 mM）诱导斑马鱼癫痫。空白对照组为0.1% DMSO，所有实验组均含有相同浓度的溶剂。每个实验组均处理8尾斑马鱼。加入药物后，利用运动/行为分析仪记录60 min内斑马鱼快速运动距离（V20 mm/sec）、中速运动距离（4V20 mm/sec）、慢速运动距离（V4 mm/sec）和总的运动距离进行分析的，确定PTZ诱导最佳评价指标。 　　1.3数据分析与统计学处理实验数据均用Mean±SE表示。用方差分析和Dunnetts T-检验进行统计学分析，P0.05表明具有显著性差异。 　　2结果 　　2.1 PTZ诱导斑马鱼癫痫模型的建立和优化以48孔板第一板摸索PTZ诱导浓度为例，分别统计分析斑马鱼不同运动速度下的运动距离，见表1。结果显示：与溶剂组相比，PTZ在5、10 mM浓度下快速运动距离显著增加（P0.05，P0.01）；而PTZ各浓度组在中速运动距离、慢速运动距离及总的运动距离各指标均无显著性差异。因此，此模型中评价指标选择快速运动距离进行统计分析，此模型中的快速运动相当于哺乳动物阵挛发作状态。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　2.2 PTZ诱导斑马鱼癫痫模型中最佳浓度确定在48孔板实验中，PTZ在5、10、20 mM浓度下，诱导组的快速运动距离较溶剂组相比，均显著增加（P 0.05）。2次实验中10 mM浓度PTZ均表现出较好的诱导效率。PTZ在30 mM浓度下，其快速运动距离较溶剂组相比，无统计学差异，较20 mM浓度相比，其快速运动距离反而降低，可能与PTZ引起斑马鱼神经毒性有关，见图1~4。在96孔板实验中，PTZ在2.5、5、10、20 mM浓度下，诱导组的快速运动距离较溶剂组相比，均显著增加（P0.01），其中10 mM浓度下，快速运动距离增加最大；PTZ在30 mM浓度下，其快速运动距离较溶剂组相比，无统计学差异，结果与48孔板中实验结果一致，见图5-6。 　　3讨论 　　药理学和毒理学评价是新药临床前安全性评价不可分割的一部分。随着创新药物开发成本的不断升高，降低药物开发过程中的损耗率日益得到关注。近年来，斑马鱼作为整体动物筛选平台已成为一种在国际上受广泛关注的全新技术。这项技术的最大优点是在筛选时可以对药