鲍姆木层孔菌米饭固体发酵条件优化及不同提取方法醇提物抗氧化活性.docVIP

鲍姆木层孔菌米饭固体发酵条件优化及不同提取方法醇提物抗氧化活性 　　以醇提物的黄酮含量为指标，通过正交试验优化了鲍姆木层孔菌（Phellinus baumii）米饭固体发酵条件，结果表明用直径5.5 cm，高10 cm的培养瓶装50 g大米，2.5%葡萄糖，0.3% KH2PO4，0.15% MgSO4?7H2O，按料液比1∶1.2 （w/v）加蒸馏水，灭菌接种后26 ℃培养27 d，发酵产物用乙醇提取得到醇提物的黄酮含量达39.8%。另外，比较了4种提取方法获得的醇提物的得率和对H2O2超氧阴离子和DPPH自由基的清除率，以评价其抗氧化活性，结果表明，烘干后乙醇冷浸提取法得到的醇提物得率最高，抗氧化活性最好。 　　鲍姆木层孔菌； 米饭； 固体发酵； 抗氧化活性 　　鲍姆木层孔菌（Phellinus baumii），俗称桑黄、桑耳，最早收载于李时珍《本草纲目》中，是一种多年生药用真菌[1]。桑黄性甘、平，味苦、辛，归肝、膀胱经，用于治疗血崩、血淋、脱肛泻血、带下、闭经、脾虚泄泻等[2]。研究表明，桑黄子实体中的多糖和黄酮类化合物有重要的生物活性[3，4]，在治疗癌症、保肝护肝、增强免疫、神经细胞损伤修复方面有重要作用[57]，但在自然界中形成的桑黄子实体稀少。 　　研究表明桑黄发酵菌丝体具有与子实体相似的活性成分，但近年来对桑黄菌丝体发酵的研究主要在液体培养条件的优化及其菌丝体的成分分析方面[8，9]。关于固体发酵桑黄菌丝体的研究还未见报道，因此笔者在已有的研究基础上，用米饭为培养基对桑黄进行固体发酵，优化了发酵条件，并比较了固体发酵醇提物的提取方法，为开发桑黄菌丝体相关产品提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1菌株 　　鲍姆木层孔菌（P. baumii）菌株3249由上海市农业科学院食用菌研究所提供。 　　1.2试剂 　　鲁米诺、1， 1二苯基2三硝基苯肼（1，1diphenyl2trinitrobenzene hydrazine， DPPH）、邻苯三酚等均为Sigma公司的产品。其它试剂均为国产分析纯。 　　1.3培养方法 　　按照L9（34）设计3水平4因素正交试验[10，11]，实验因素和水平见表1，按料液比1∶1.2 （w/v）加蒸馏水。采用聚乙烯塑料培养瓶（直径5.5 cm，高10 cm），按表1的配方装入培养基，121 ℃灭菌 30 min，接入3块1 cm2活化的菌块（菌株接于PDA斜面26 ℃培养7 d）于26 ℃培养27 d。各处理采用文献[12]的方法制备醇提物并测定醇提物中总黄酮含量。 　　1.4固体发酵醇提物的提取方法 　　选择1.3中的最优培养条件制备桑黄固体发酵物用于提取方法的比较。 　　1.4.1烘干后乙醇浸提（方法A） 　　固体发酵物从培养瓶中取出，捣碎，放入30 ℃烘箱烘至恒重，加入10倍体积（w/v）的80%乙醇，浸泡24 h，过滤，重复上述操作1次，合并提取液，减压浓缩去除乙醇，真空离心浓缩（1000 g， 60 ℃）至干燥，得到醇提物（命名为A）。 　　1.4.2冻干后乙醇浸提 （方法B） 　　固体发酵物于冷冻干燥机中冻干，粉碎，醇提物的提取方法同1.4.1，得醇提物B。 　　1.4.3冻干后微波助提（方法C） 　　固体发酵物于冷冻干燥机中冻干，粉碎，加入10倍体积（w/v）的80%乙醇，微波（35 ℃，120 mA，DS系列Sanyou微波提取仪，中山市三友自动化仪表有限公司） 提取30 min，过滤，重复上述操作1次，合并滤液，其余操作同1.4.1，得醇提物C。 　　1.4.4冻干后超声提取（方法D） 　　固体发酵物于冷冻干燥机中冻干，粉碎，加入10倍体积（w/v）的80%乙醇，超声提取（35 ℃，40 kHz，600 W，KQ600B超声仪，昆山市超声仪器有限公司）30 min，过滤，重复上述操作1次，合并滤液，其余操作同1.4.1，得醇提物D。 　　1.5清除H2O2实验 　　各醇提物分别用70%乙醇分别配成1、10、20、50 μg/mL的溶液，对H2O2的清除实验使用鲁米诺-H2O2发光反应体系，按文献[13]的实验方法测定H2O2清除率。 　　1.6清除超氧阴离子实验 　　各醇提物分别用70%乙醇溶解分别配成0.5、0.8、1.0、2.0 mg/mL的溶液。采用鲁米诺邻苯三酚-CBS体系的化学发光法，参照[14]的方法，各浓度样品分别取10 μL加入96孔板，用70%乙醇做空白对照，由泵1泵入10 μL 6.25×10-4 mol/L邻苯三酚溶液，泵2泵入150 μL鲁米诺CBS溶液（pH 10.2）。在20 ℃启动发光反应，每0.6 s收集一次光信号，连续收集30 s，记录相对发光强度，计算清除率。超氧阴离子的清除