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临床用药帕博西尼与匹莫齐特抑制IgE 介导的肥大细胞活化及其作用机制的研究 摘要 背景：过敏性疾病，包括过敏性哮喘，过敏性鼻炎和特异性皮炎，是免疫系统超敏 反应引起的常见疾病。随着社会的发展，过敏性疾病的发病率逐年增加。肥大细胞作为 先天免疫的主要效应细胞之一，通过释放各种炎症介质在过敏性疾病的发病中起主要作 用。因此，肥大细胞是治疗过敏性炎症的关键靶标。目前，抗组胺药物和类固醇药物的 使用仍然是临床上治疗过敏性疾病的主要策略，但是其存在副作用和不良反应。同时越 来越多的生物制剂也应用于临床，但是其复杂的剂量和管理方式导致其无法大范围推广。 因此，过敏性疾病的治疗需要新的治疗策略以便于为患者提供更好的选择。我们在研究 中发现临床用药帕博西尼和匹莫齐特对于肥大细胞的活化具有抑制作用。帕博西尼和匹 莫齐特已经被美国 FDA 批准用于临床疾病的治疗，其中帕博西尼已经被批准为雌激素 受体阳性（ER + ）/人表皮生长因子受体2 阴性（HER2- ）晚期乳腺癌的一线治疗药物； 匹莫齐特则被批准用于慢性精神病、Tourette 综合征和耐药性抽动症的治疗。 目的：1.研究临床用药帕博西尼和匹莫齐特在体外实验中对于IgE 介导的肥大细胞 活化及脱颗粒的效应；2.探究临床用药帕博西尼和匹莫齐在被动皮肤过敏反应（PCA ） 和卵清蛋白（OVA ）诱导的主动系统性过敏反应（ASA ）体内模型中对于体内过敏反应 的影响；3.通过免疫印迹技术检测肥大细胞活化过程中相关的信号分子的表达探究帕博 西尼和匹莫齐特对于肥大细胞活化的作用机制。 方法：1.通过使用抗二硝基苯酚（DNP ）免疫球蛋白E （IgE ）抗体致敏大鼠嗜碱性 粒细胞（RBLs ）和小鼠骨髓来源的肥大细胞（BMMCs ），用帕博西尼和匹莫齐特分别预 处理细胞后用DNP-人血清白蛋白（HSA ）抗原刺激，之后检测相关细胞介质的释放（组 胺和β-氨基己糖苷酶）和肥大细胞活化表面标志物CD63 的表达。2.肥大细胞的活化与 其形态变化有关，通过甲苯胺蓝染色可以观察到肥大细胞的形态，而F-肌动蛋白作为阻 止细胞活化期间颗粒进入质膜的屏障，F-肌动蛋白的重排允许颗粒内的内容物从细胞中 分泌出来，通过鬼笔环肽染色然后在荧光显微镜下观察F-肌动蛋白的含量来区分肥大细 胞的状态从而观察其脱颗粒的程度。3. 鼠IgE 介导的被动皮肤过敏反应（PCA ）和卵清 蛋白（OVA ）诱导的主动系统性过敏反应（ASA ）模型用于检测帕博西尼和匹莫齐特对 I 临床用药帕博西尼与匹莫奇特抑制IgE 介导的肥大细胞活化及其作用机制的研究 体内过敏反应的影响。4.使用免疫印迹法检测与肥大细胞活化相关的信号分子的表达。 结果：帕博西尼在 100μM 时与对照组相比其细胞活力没有显著性差异，表明帕博 西尼在 100μM 时不影响肥大细胞的活性。帕博西尼以浓度依赖的方式抑制IgE 介导的 RBLs 和BMMCs 中β 氨基己糖苷酶和组胺的释放，在40μM 时显著抑制脱颗粒物质的 释放(p 0.05, p 0.01 ，与DNP-HSA 组比较) 。流式细胞结果显示帕博西尼抑制了肥大 细胞表面活化标记物CD63 的上调(p 0.05, p 0.01 ，与DNP-HSA 组比较) 。甲苯胺蓝 染色和鬼笔环肽染色的结果表明，帕博西尼抑制了肥大细胞中与活化相关的形态变化和 丝状激动蛋白的重组，抑制了肥大细胞的脱颗粒。帕博西尼同样减弱了被动皮肤过敏反 应（PCA ）中小鼠的耳朵厚度的增加和伊文思蓝染料从反应部位的渗出(p 0.05,p 0.01, 与DNP-HSA 组比较) ，并且在OVA 诱导的主动系统性过敏反应中抑制了直肠温度降低 的反应及炎症介质IL-4,IL-10 的释放(p 0.01 ，与OVA 刺激组比较) 。免疫印迹结果显 示帕博西尼抑制了与肥大细胞活化相关的分子p-Lyn 和p-p38,p-JNK,p-ERK1/2 的活化， 之后通过检测β-氨基己糖苷酶释放率的结果表明在使用siRNA 下调肥大细胞Lyn 的表 达或者使用ERK 抑制剂U0126 ，JNK 抑制剂SP600125 和p38 抑制剂SB203580 之后不 会影响帕博西尼对于肥大细胞活化的抑制作用。 匹莫齐特在浓度最高为100 μM 时对于RBLs 和BMMC