去泛素化酶UCH-L5及POH1在脑胶质瘤发生发展中的作用及机制研究.pdfVIP

去泛素化酶 UCH-L5 及 POH1 在脑胶质瘤发生发展中的作用及机制研究 摘要 脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，占原发性中枢神经系统肿瘤的 36%以上，具有 高发病率，高死亡率等特点。脑胶质瘤治疗主要以手术切除、放疗、化疗和药物联合等 传统疗法为主，但治疗后患者预后差，易复发。脑胶质瘤发病机制尚不明确，深入研究 胶质瘤发生发展中的关键蛋白分子及其调控机制，对于寻找胶质瘤治疗的新靶点及有效 治疗药物具有重要意义。 泛素蛋白酶体系统由泛素活化酶 E1，泛素结合酶E2，泛素连接酶E3，去泛素化酶， 26S 蛋白酶体系统组成，是真核生物维持蛋白稳态的主要途径之一。去泛素化酶作为泛 素蛋白酶体系统的成员之一，可以将单泛素分子或者多泛素链从被泛素化修饰的底物蛋 白上特异性去除，使底物蛋白去泛素化，对蛋白稳态的调节发挥着重要作用。UCH-L5、 POH1 分别属于两种不同的去泛素化酶家族，UCH-L5 属于 UCHs 家族，POH1 属于 JAMMs 家 族。生物信息学及临床组织样本检测发现：相较于脑正常组织，UCH-L5 在脑胶质瘤组织 中低表达，POH1 在脑胶质瘤组织中高表达，提示 UCH-L5、POH1 可能参与了胶质瘤的发 生发展。而 UCH-L5、POH1 在脑胶质瘤细胞增殖与肿瘤发生发展中的作用和分子机制尚 有待进一步阐明。 应用 EDU 分析法和克隆形成实验检测细胞增殖，我们发现敲低 UCH-L5 表达促进脑 胶质瘤细胞 U251 细胞的增殖。我们实验室之前的研究已经证明稳定敲减 UCH-L5 促进 U251 细胞增殖与荷瘤裸鼠胶质瘤的生长；但是敲低 UCH-L5 对 U87MG 脑胶质瘤细胞增殖 未见影响，机制不清楚。结合PTEN 在 U87MG 细胞中缺失的文献报道，我们推测 PTEN 可 能为 UCH-L5 的分子靶标。利用特异性 siRNA 干扰 U251 细胞中 UCH-L5 表达，Western blot 检测蛋白表达发现 U251 中PTEN 和磷酸化 PTEN 蛋白水平显著降低，RT qPCR 结果 显示 PTEN mRNA 水平没有变化。慢病毒介导的 UCH-L5 稳定敲低的 U251 细胞系中，PTEN 和磷酸化 PTEN 蛋白水平显著下调。我们用抑制 UCH-L5 去泛素化酶活性的 b-AP15 抑制 剂处理 U251 细胞，U251 细胞中 PTEN 蛋白表达下调。在脑胶质瘤细胞系 U251 中干扰 UCH-L5 表达可促进 PTEN 蛋白的降解，该效应可被蛋白酶体抑制剂 MG132 逆转，而溶酶 体抑制剂 CQ 无作用。IP 实验结果证实在胶质瘤细胞系 U251 中干扰UCH-L5 表达可增加 PTEN 的泛素化。在 HEK293 细胞中，过表达 UCH-L5 可促进 PTEN 的去泛素化。 因此， I 去泛素化酶 UCH-L5 及 POH1 在脑胶质瘤发生发展中的作用及机制研究 UCH-L5 可能通过调节 PTEN 稳定性抑制 U251 胶质瘤细胞的增殖。 TCGA 数据库信息和脑组织芯片免疫组化结果表明，POH1在脑胶质瘤中是高表达的。 CCK8 结果表明敲低 POH1 抑制了 A172 脑胶质瘤细胞增殖，流式结果显示敲低 POH1 促进 A172 脑胶质瘤细胞凋亡。Transwell 和划痕实验证明敲低 POH1 抑制 A172 细胞迁移和侵 袭。我们通过查阅文献和实验验证，进一步探索了 POH1 调节脑胶质瘤发生的分子机制。 Western blot 检测相关蛋白表达，敲低 POH1 抑制 TGF- β/Smads 信号通路活化，下调 TGF- β/Smads 信号通路下游转录因子 ZEB1 蛋白表达，RT qPCR 结果显示敲低 POH1 不影 响 ZEB1 mRNA 水平。应用蛋白合成抑制剂 CHX 处理 A172 细胞，敲低 POH1 导致 ZEB1 蛋 白稳定性降低。在脑胶质瘤细胞系 A172 中干扰 POH1 表达可促进 ZEB1 蛋白的降解，该 效应可被蛋白酶体抑制剂 MG132 逆转，而溶酶体抑制剂 CQ 无作用。TCGA 数据库信息显 示，在低级别胶质瘤患者中，POH1 与 ZEB1 表达成正相关。 本研究中，我们发现 UCH-L5 可调节 PTEN 蛋白稳定性抑制 U251 脑胶质瘤细胞增殖。 POH1 促进 A172 脑胶质瘤细胞增殖、迁移与侵袭，抑制